БАКТЕРИАЛЬНЫЙ МАЗОК: ХАРАКТЕРИСТИКА И ПОДГОТОВКА - БИОЛОГИЯ - 2025

Бактериального мазка представляет собой тонкую пленку мазок из суспензии бактериальных микроорганизмов , который сделан на прозрачной стеклянной пластине или слайд, для наблюдения под световым микроскопом.

Растяжка в виде пленки проводится для того, чтобы максимально отделить микроорганизмы, так как если они сгруппированы, наблюдение неясно.

Рисунок 1. Бактериальный мазок под растровым электронным микроскопом. Источник: pixbay.com

При исследовании бактериальных культур используются методы подготовки, фиксации и окрашивания мазков для их лучшего анализа. Из-за небольшого размера микроорганизмов для их наблюдения обязательно требуется использование оптического микроскопа.

Оптические микроскопы - незаменимые инструменты для наблюдения за мазками. В них используются оптические линзы и свет, позволяющие рассматривать образцы с большим увеличением.

В общем, живые клетки не имеют преимущественно окрашенных структур, которые можно увидеть в световой микроскоп, они представляют собой бесцветные, прозрачные образцы, и они демонстрируют очень слабый внутренний контраст с окружающей средой.

Наблюдение с помощью простого светового микроскопа без использования вспомогательных методов окрашивания очень ограничено и используется только в некоторых случаях, например, при наблюдении за движением микроорганизмов.

Для оптимального наблюдения за микроорганизмами необходимо соблюдать баланс между контрастностью и разрешением. Детали клеток нельзя увидеть под микроскопом даже с высоким разрешением; Использование красителей требуется с помощью методов окрашивания, которые обеспечивают контраст для наблюдения.

Характеристики бактериального мазка хорошего качества

Отличный контраст

Для достижения превосходного контраста существуют сложные микроскопы, называемые фазово-контрастными микроскопами, дифференциальными интерференционными микроскопами и микроскопами темного поля. Этот тип микроскопа используется для наблюдения за бактериальными структурами, такими как оболочки и волокна, среди прочего.

Окрашивание - это простой метод увеличения контраста, который достигается с помощью светлопольного микроскопа. В этом методе можно использовать различные красители, которые значительно улучшают микроскопическое наблюдение.

Окрашивание проводится непосредственно на мазках или расширениях суспензий микроорганизмов на предметных стеклах, предварительно высушенных и зафиксированных.

Хорошее исправление

Фиксация - это метод сохранения клеточных структур; вызывает инактивацию микроорганизмов и прилипание к стеклу предметного стекла. Существуют различные способы фиксации: термофиксация и химическая фиксация.

Тепловая фиксация

Это наиболее широко используемый метод исследования бактериальных мазков. Методика заключается в пропускании бактериальной взвеси мазка через пламя зажигалки. Эта техника способна сохранить внешнюю морфологию бактерий, но разрушает их внутренние структуры.

Химическая фиксация

В химической фиксации используются консерванты, такие как формальдегид или формалин, этанол и уксусная кислота, среди прочих. Преимущество использования химических фиксаторов в том, что достигается сохранение внутренних клеточных структур микроорганизмов.

Рисунок 2. Мазок крови. Источник: Bobjgalindo, Wikimedia Commons.

Хорошее окрашивание

Наиболее распространенными процедурами окрашивания предварительно высушенного и фиксированного мазка являются положительное или простое окрашивание, дифференциальное окрашивание и отрицательное окрашивание. Также существуют специальные техники окрашивания отдельных клеточных структур (капсулы, споры, жгутиков).

Положительное окрашивание или простое окрашивание

Положительное или простое окрашивание - наиболее широко используемый метод окрашивания мазков. В нем используются красители, которые обладают способностью связываться с определенными микробными структурами, что позволяет наблюдать за ними под микроскопом.

Эти красители имеют в своей химической структуре хромофорные группы (окрашенную часть) с чередующимися двойными и одинарными связями (конъюгация). Эти связи, в свою очередь, могут устанавливать ионные или ковалентные связи с некоторыми клеточными структурами.

Красители, используемые для положительного или простого окрашивания, в основном представляют собой химические производные анилина (окрашенные органические соли).

С другой стороны, среди красителей мы можем найти одни с основным pH, а другие с кислым pH.

Базовые красители

В основных красителях хромофорная группа имеет положительный электрический заряд. Подавляющее большинство прокариотических микроорганизмов имеют нейтральный внутренний pH, а их клеточная поверхность заряжена отрицательно. Благодаря этому электростатическому взаимодействию хромофор связывается с клеткой и окрашивает ее.

Примерами основных красителей являются метиленовый синий, кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый, основной фусцин, сафранин и другие.

Кислотные красители

В кислотных красителях хромофорная группа имеет отрицательный электрический заряд. Они используются для окрашивания белков с положительно заряженными аминогруппами. Примерами кислотных красителей являются кислый фусцин, бенгальская роза, красный конго и эозин.

Дифференциальное окрашивание

Техника дифференциального окрашивания заключается в применении двух красителей разного цвета или интенсивности для различения различных микроорганизмов под микроскопом. Окрашивание по Граму и кислотно-спиртовое окрашивание - наиболее часто используемые дифференциальные красители в бактериологии.

Окрашивание по Граму используется в качестве предварительного теста для определения формы, размера, группировки клеток, а также типа клеточной стенки. С помощью теста окрашивания по Граму бактерии клеточной стенки классифицируются на грамположительные бактерии и грамотрицательные бактерии.

Отрицательное окрашивание

В этом методе используются химические красители, которые не проникают внутрь клетки, но делают среду, в которой находятся микроорганизмы, черным фоном.

В технике негативного окрашивания мазок наносится с помощью капли индийских чернил или суспензии нигрозина, которая после высыхания при комнатной температуре образует непрозрачную пленку для прохождения света. Таким образом, микроорганизмы выглядят как яркие формы на темном фоне.

подготовка

А. Мазок

1.- Тщательно вымойте слайды, высушите промокательной бумагой и промаркируйте их. На этикетке должно быть указано содержание препарата, дата и имя человека, который его обработал.

2.- Зажгите зажигалку и простерилизуйте посевную петлю в пламени до ярко-красного цвета.

3.- Дайте ручке остыть.

4.- Возьмите пробирку с бактериальной культурой, снимите крышку и быстро проведите горлышко пробирки возле пламени горелки (пламени).

5.- Вставьте инокуляционную петлю в пробирку с бактериальной культурой и возьмите образец.

6.- Если культура находится в жидкой среде, поместите образец, взятый ручкой, в центре предметного стекла и осторожно распределите его по кругу диаметром примерно 2 см.

7.- Снова простерилизуйте инокуляционную петлю.

8.- Дайте мазку высохнуть на воздухе.

9.- Повторите шаги с 3 по 8 три раза.

10.- Если культура находится в твердой среде, на предметное стекло необходимо предварительно нанести каплю дистиллированной воды. Это делается для смешивания небольшого образца культуры, взятого с помощью петли для посева, как указано в этапах 2–5 (асептические условия).

11.- Нанесите разбавленный образец каплей воды на предметное стекло и повторите три раза.

Б. Фиксация

1.- Добавьте две капли метанола или абсолютного этанола в сухие мазки - от культур в жидкой среде -.

2.- Дайте возможность воздуху высохнуть вдали от зажигалки.

3.- Если мазок получен из культуры в твердой среде, сухой мазок фиксируют с помощью тепла, быстро пропуская его 2-3 раза через самую горячую часть пламени зажигалки.

4.- Коснитесь нижней части мазка тыльной стороной левой руки (для правой руки; в противном случае используйте правую руку) и убедитесь, что он холодный.

С. Простое окрашивание

1.- Добавьте 2 капли выбранного пятна в мазок и дайте ему подействовать в течение времени, требуемого в конкретных протоколах для каждого пятна (обычно от 1 до 5 минут).

2.- Некоторые пятна требуют использования тепла для их активации, и в этом случае необходимо быть очень осторожным при нагревании предметного стекла в пламени зажигалки (манипулируйте им пинцетом и избегайте кипения). Перегрев мазка может разрушить наблюдаемые клетки.

3.- Удалите излишки красителя, промыв дистиллированной водой с пипетки. Удалите промывочную воду, осторожно постучав слайдом по краю, наклоненному на рабочий стол.

4.- Дайте высохнуть на воздухе.

5.- В зависимости от типа наблюдения, на данном этапе используется или не используется покровное стекло. Покровное стекло защищает и сохраняет мазок. Если на этом этапе проводится наблюдение с масляной иммерсией, покровные стекла не используются, но мазок не может быть сохранен.

D. Окончательное сохранение мазка

1.- Погрузите мазок последовательно в каждый из указанных ниже растворов минимум на 5 минут. Цель этих «ванн» - полностью обезвожить мазок. Каждый реагент следует тщательно слить, прежде чем вводить мазок в следующую ванну.

Порядок проведения обезвоживающих ванн следующий:

1. Этанол 70%
2. Этанол 95%
3. Чистый ацетон
4. Смесь ацетон-ксилол 1: 1
5. Ксилол

Затем дайте высохнуть на воздухе.

2.- Установите покровное стекло, предпочтительно 22 × 22 мм, используя канадский бальзам или другой монтажный материал.

Ссылки

1. Бриггс, Г. (1965). Причинные факторы несчастных случаев в микробиологических лабораториях и инфекций. Биологические лаборатории армии США. Форт Детрик.
2. Капучино, Дж. Г. и Уэлч, Коннектикут (2017). Микробиология: лабораторное руководство. Пирсон.
3. Холт, редактор JG. (1977). Более короткое Руководство Берджи по детерминантной бактериологии. 8- ^й Балтимор: Уильямс и Уилкинс Ко.
4. Джонсон, Т.Р. и Кейс; CL (2018). Лабораторные эксперименты в микробиологии. Пирсон.
5. Тилле, П. (2017). Диагностическая микробиология. 14- ^й Сент-Луис, США: Elsiever, Inc.