РЕСТРИКЦИОННЫЕ ФЕРМЕНТЫ: ФУНКЦИИ, ТИПЫ И ПРИМЕРЫ - БИОЛОГИЯ - 2025

Эти ферменты рестрикции являются эндонуклеазы , используемые некоторыми архей и бактерий для ингибирования или «ограничить» распространение вирусов внутри. Они особенно распространены у бактерий и являются частью их системы защиты от чужеродной ДНК, известной как система рестрикции / модификации.

Эти ферменты катализируют расщепление двухполосной ДНК в определенных местах, воспроизводимо и без использования дополнительной энергии. Для большинства из них требуется присутствие кофакторов, таких как магний или другие двухвалентные катионы, хотя для некоторых также требуется АТФ или S-аденозилметионин.

Схема реакции рестрикционного фермента HindIII (Источник: Helixitta через Wikimedia Commons)

Эндонуклеазы рестрикции были открыты в 1978 году Дэниелом Натансом, Арбером Вернером и Гамильтоном Смитом, получившими за свое открытие Нобелевскую премию по медицине. Их название обычно происходит от организма, в котором они впервые наблюдаются.

Такие ферменты широко используются при разработке методов клонирования ДНК и других стратегий молекулярной биологии и генной инженерии. Их специфические характеристики распознавания последовательностей и способность разрезать последовательности вблизи сайтов узнавания делают их мощными инструментами в генетических экспериментах.

Фрагменты, генерируемые рестрикционными ферментами, которые воздействовали на конкретную молекулу ДНК, могут быть использованы для воссоздания «карты» исходной молекулы с использованием информации о сайтах, где фермент разрезал ДНК.

Некоторые рестрикционные ферменты могут иметь один и тот же сайт узнавания на ДНК, но они не обязательно разрезают его таким же образом. Таким образом, существуют ферменты, которые разрезают оставшиеся тупые концы, и ферменты, разрезающие оставшиеся липкие концы, которые имеют различные применения в молекулярной биологии.

В настоящее время существуют сотни различных коммерчески доступных рестрикционных ферментов, предлагаемых различными коммерческими компаниями; Эти ферменты действуют как «нестандартные» молекулярные ножницы для различных целей.

Характеристики

Рестрикционные ферменты выполняют функцию, противоположную полимеразам, поскольку они гидролизуют или разрывают сложноэфирную связь внутри фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами в нуклеотидной цепи.

В молекулярной биологии и генной инженерии они широко используются для создания векторов экспрессии и клонирования, а также для идентификации конкретных последовательностей. Они также полезны для создания рекомбинантных геномов и обладают большим биотехнологическим потенциалом.

Недавние достижения в генной терапии позволяют использовать в настоящее время рестрикционные ферменты для введения определенных генов в векторы, которые являются носителями для транспорта таких генов в живые клетки и которые, вероятно, обладают способностью вставляться в клеточный геном для выполнения постоянные изменения.

Механизм действия

Рестрикционные ферменты могут катализировать двухполосное расщепление ДНК, хотя некоторые из них способны распознавать однодиапазонные последовательности ДНК и даже РНК. Обрезка происходит после распознавания последовательностей.

Механизм действия заключается в гидролизе фосфодиэфирной связи между фосфатной группой и дезоксирибозой в скелете каждой цепи ДНК. Многие из ферментов способны разрезать на том же участке, который они распознают, в то время как другие разрезают от 5 до 9 пар оснований до или после этого.

Эти ферменты обычно разрезают 5'-конец фосфатной группы, давая фрагменты ДНК с 5'-фосфорильным концом и 3'-концевым гидроксильным концом.

Поскольку белки не вступают в прямой контакт с сайтом узнавания в ДНК, они должны перемещаться последовательно, пока не будет достигнут конкретный сайт, возможно, с помощью механизмов «скольжения» по цепи ДНК.

Во время ферментативного расщепления фосфодиэфирная связь каждой из цепей ДНК располагается внутри одного из активных сайтов рестрикционных ферментов. Когда фермент покидает сайт узнавания и расщепления, он делает это посредством неспецифических временных ассоциаций.

Типы

В настоящее время известно пять типов рестрикционных ферментов. Вот краткое описание каждого из них:

Ферменты рестрикции I типа

Эти ферменты представляют собой большие пентамерные белки с тремя субъединицами: одна для рестрикции, одна для метилирования и одна для распознавания последовательности в ДНК. Эти эндонуклеазы представляют собой многофункциональные белки, способные катализировать реакции рестрикции и модификации, они обладают АТФазной активностью, а также ДНК-топоизомеразой.

Ферменты этого типа были первыми открытыми эндонуклеазами, они были впервые очищены в 1960-х годах и с тех пор тщательно изучаются.

Ферменты типа I не используются широко в качестве биотехнологического инструмента, поскольку сайт расщепления может находиться на разном расстоянии до 1000 пар оснований от сайта узнавания, что делает их ненадежными с точки зрения экспериментальной воспроизводимости.

Ферменты рестрикции типа II

Это ферменты, состоящие из гомодимеров или тетрамеров, которые разрезают ДНК в определенных участках длиной от 4 до 8 п.н. Эти сайты расщепления обычно являются палиндромными, то есть они распознают последовательности, которые читаются одинаково в обоих направлениях.

Многие рестрикционные ферменты типа II в бактериях разрезают ДНК, когда узнают ее чужеродный характер, поскольку она не имеет типичных модификаций, которые должна иметь ее собственная ДНК.

Это простейшие рестрикционные ферменты, поскольку они не требуют каких-либо кофакторов, кроме магния (Mg +), для распознавания и разрезания последовательностей ДНК.

Точность рестрикционных ферментов типа II в распознавании и разрезании простых последовательностей в ДНК в точных положениях делает их одними из наиболее широко используемых и незаменимых в большинстве областей молекулярной биологии.

Внутри группы рестрикционных ферментов типа II существует несколько подклассов, классифицированных в соответствии с определенными свойствами, уникальными для каждого из них. Классификация этих ферментов осуществляется путем добавления букв алфавита от A до Z после названия фермента.

Некоторые из подклассов, наиболее известных своей полезностью:

Подкласс IIA

Это димеры разных субъединиц. Они распознают асимметричные последовательности и используются в качестве идеальных предшественников для создания режущих ферментов.

Подкласс IIB

Они состоят из одного или нескольких димеров и разрезают ДНК по обе стороны от последовательности распознавания. Они разрезают обе нити ДНК на интервал пары оснований перед сайтом узнавания.

Подкласс IIC

Ферменты этого типа представляют собой полипептиды с функциями деления и модификации цепей ДНК. Эти ферменты асимметрично разрезают обе нити.

Подкласс IIE

Ферменты этого подкласса чаще всего используются в генной инженерии. У них есть каталитический сайт и обычно требуется аллостерический эффектор. Этим ферментам необходимо взаимодействовать с двумя копиями их последовательности узнавания, чтобы выполнить эффективное расщепление. В этот подкласс входят ферменты EcoRII и EcoRI.

Ферменты рестрикции типа III

Эндонуклеазы рестрикции типа III состоят только из двух субъединиц, одна отвечает за распознавание и модификацию ДНК, а другая - за расщепление последовательности.

Эти ферменты требуют для своей работы двух кофакторов: АТФ и магния. Ферменты рестрикции этого типа обладают двумя асимметричными сайтами узнавания, транслоцируют ДНК АТФ-зависимым образом и разрезают ее на 20–30 п.н. рядом с сайтом узнавания.

Ферменты рестрикции типа IV

Ферменты типа IV легко идентифицировать, поскольку они разрезают ДНК метками метилирования, они состоят из нескольких различных субъединиц, которые отвечают за распознавание и разрезание последовательности ДНК. Эти ферменты используют GTP и двухвалентный магний в качестве кофакторов.

Специфические сайты расщепления включают нуклеотидные цепи с метилированными или гидроксиметилированными остатками цитозина на одной или обеих цепях нуклеиновых кислот.

Ферменты рестрикции типа V

Эта классификация группирует ферменты типа CRISPER-Cas, которые идентифицируют и вырезают определенные последовательности ДНК из вторгающихся организмов. Ферменты Cas используют цепь синтезированной CRISPER направляющей РНК для распознавания и атаки вторгающихся организмов.

Ферменты, классифицируемые как тип V, представляют собой полипептиды, структурированные ферментами типа I, II и II. Они могут вырезать участки ДНК практически любого организма и в широком диапазоне длин. Их гибкость и простота использования делают эти ферменты одними из наиболее широко используемых сегодня инструментов в генной инженерии наряду с ферментами типа II.

Примеры

Ферменты рестрикции использовались для обнаружения полиморфизмов ДНК, особенно в популяционно-генетических исследованиях и эволюционных исследованиях с использованием митохондриальной ДНК, с целью получения информации о скорости нуклеотидных замен.

В настоящее время векторы, используемые для трансформации бактерий для различных целей, обладают сайтами многоклонирования, где обнаруживаются сайты узнавания для множества рестрикционных ферментов.

Среди этих ферментов наиболее популярными являются EcoRI, II, III, IV и V, полученные и впервые описанные из E. coli; HindIII из H. influenzae и BamHI из B. amyloliquefaciens.

Ссылки

1. Бикл Т.А. и Крюгер Д.Х. (1993). Биология рестрикции ДНК. Microbiological Reviews, 57 (2), 434–450.
2. Боявал П., Мойно С., Ромеро Д.А. и Хорват П. (2007). CRISPR обеспечивает приобретенную устойчивость к вирусам у прокариот. Science, 315 (март), 1709–1713.
3. Гудселл, Д. (2002). Молекулярная перспектива: эндонуклеазы рестрикции. Стволовые клетки: основы медицины рака, 20, 190–191.
4. Халфорд, С.Е. (2001). Прыжки, прыжки и зацикливание за счет рестрикционных ферментов. Biochemical Society Transactions, 29, 363-373.
5. Ельч, А. (2003). Поддержание видовой идентичности и контроль видообразования бактерий: новая функция для систем рестрикции / модификации? Джин, 317, 13-16.
6. Кребс, Дж., Гольдштейн, Э., и Килпатрик, С. (2018). Lewin's Genes XII (12 изд.). Берлингтон, Массачусетс: Джонс и Бартлетт Обучение.
7. Ли, Ю., Пан, С., Чжан, Ю., Рен, М., Фэн, М., Пэн, Н.,… Она, К. (2015). Использование систем CRISPR-Cas типа I и типа III для редактирования генома. Исследование нуклеиновых кислот, 1–12.
8. Loenen, WAM, Драйден, DTF, Роли, EA, и Уилсон, GG (2013). Рестрикционные ферменты I типа и их родственники. Исследования нуклеиновых кислот, 1–25.
9. Натанс Д. и Смит Х.О. (1975). Эндонуклеазы рестрикции в анализе и реструктуризации молекул ДНК. Annu. Rev. Biochem. , 273–293.
10. Nei, M., & Tajima, F. (1981). Полиморфизм ДНК обнаруживается эндонуклеазами рестрикции. Генетика, 145-163.
11. Пингоуд А., Фуксрайтер М., Пингоуд В. и Венде В. (2005). Клеточные и молекулярные науки о жизни Эндонуклеазы рестрикции типа II: структура и механизм. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685–707.
12. Робертс, Р. (2005). Как рестрикционные ферменты стали рабочими лошадками молекулярной биологии. PNAS, 102 (17), 5905–5908.
13. Робертс, Р. Дж., И Мюррей, К. (1976). Эндонуклеазы рестрикции. Критические обзоры в биохимии, (ноябрь), 123–164.
14. Стоддард, Б.Л. (2005). Структура и функции самонаводящейся эндонуклеазы. Ежеквартальные обзоры биофизики, 1–47.
15. Ток, М. Р., и Драйден, DTF (2005). Биология ограничения и анти-ограничения. Текущее мнение в микробиологии, 8, 466–472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
16. Уилсон, Г.Г., и Мюррей, NE (1991). Системы ограничений и модификаций. Annu. Преподобный Жене. , 25, 585-627.
17. Ву, З., и Мо, К. (2016). Геномное понимание вирулентности Campylobacter jejuni и популяционной генетики. Infec. Дис. Перев. Мед., 2 (3), 109–119.
18. Юань Р. (1981). Структура и механизм многофункциональных рестрикционных эндонуклеаз. Annu. Rev. Biochem. , 50, 285-315.