ПРОТЕИНАЗА K: ХАРАКТЕРИСТИКИ, ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ, ПРИМЕНЕНИЕ - БИОЛОГИЯ - 2025

К протеиназы представляет собой фермент , принадлежащий к группе сериновых протеаз, т.е. она имеет в своей средней серин каталитически активной аминокислоты и имеет функцию разрыва пептидных связей путем гидролиза. В свою очередь, этот фермент принадлежит к семейству белков субтилизина (пептидаза S8).

Протеиназа К имеет молекулярную массу (MW) 28 900 дальтон и была впервые выделена в 1974 г. из экстрактов гриба Engyodontium album, ранее известного как Tritirachium album Limber.

Молекулярная структура протеиназы К. Источник: Lykchiniadis

Он обладает высокой протеолитической способностью, что демонстрируется способностью разрушать кератин, присутствующий в волосах. Слово кератин на английском языке пишется как «кератин», поэтому его назвали «протеиназой К».

Благодаря своей высокой способности расщеплять нативные белки этот фермент полезен в различных методах молекулярной биологии. Он в основном используется для выделения и получения нуклеиновых кислот с высокой молекулярной массой (MW).

Протеиназа К работает, высвобождая ядерную ДНК, разрушая при этом белки и инактивируя РНКазы и ДНКазы, то есть устраняя нуклеазы в препаратах ДНК и РНК.

С другой стороны, было замечено, что протеиназа К может гидролизовать некоторые денатурированные нативные белки, что вызвало интерес исследователей к ее использованию в изучении прионных белков (PrPC).

Однако, несмотря на их высокую протеолитическую активность, существуют белки, устойчивые к действию протеиназы К. Среди них есть некоторые аномальные белки, называемые прионами (PrPSc), связанные с трансмиссивными губчатыми энцефалопатиями.

Характеристики протеиназы К

Протеиназа К имеет третичную структуру, состоящую из трех слоев, с семицепочечным β-листом, расположенным между двумя слоями спиралей. Поскольку он принадлежит к семейству пептидаз S8, он характеризуется наличием каталитической триады в его активном центре, чей последовательный порядок (Asp, His и Ser), что отличает их от других семейств пептидаз.

Этот фермент из группы сериновых протеаз характеризуется гидролизом пептидных связей, близких к карбоксильной группе алифатических и ароматических аминокислот.

С другой стороны, он способен действовать в присутствии некоторых коррозионных веществ, таких как додецилсульфат натрия (SDS), Tris-HCL и EDTA, которые используются для денатурации белков, что приводит к потере их естественной структуры.

Это предварительный этап подготовки белков для электрофореза. Диапазон pH, в котором действует протеиназа K, довольно широк (от 2,0 до 12,0), с оптимальным значением pH от 7,5 до 12,0, а его изоэлектрическая точка составляет 8,9. Как видно, он активен в очень широком диапазоне pH.

Другой особенностью протеиназы К является ее стабильность при высоких температурах (50-60 ° C).

Ферментативная активность

Протеиназа К требует присутствия иона кальция, хотя это не влияет на ее активность, если необходимо поддерживать ее стабильность.

Чтобы протеиназа К полностью переварила субстрат, необходимо время контакта от 5 минут до 2 часов.

Однако в этом смысле Даза и др. Сравнили чистоту ДНК, полученную в разное время воздействия против протеиназы К, и пришли к выводу, что длительная инкубация (до 24 часов) значительно улучшает качество ДНК.

Однако в отношении концентрации фермента протеиназы К, используемой в различных протоколах, можно сказать, что она очень различается.

Его можно использовать от очень низких концентраций (5 мкг / мл) до концентраций 500 мкг / мл. Но наиболее распространенные рабочие концентрации колеблются от 50 до 100 мкг / мл, особенно для переваривания белков и инактивации нуклеаз. Хотя для обработки тканей требуется концентрация 2 мг / мл.

Приложения

Его области применения очень широки и могут быть резюмированы следующим образом:

-Он используется для переваривания белков и экстракции ДНК различными методами, такими как: высаливание, PK-SDS, бромид цетилтриметиламмония (CTAB), модифицированный ацетат калия и экстракция йодидом натрия.

-Инактивация нуклеаз (РНКаз и ДНКаз).

-В методике гибридизации in situ (HIS), чтобы способствовать высвобождению нуклеиновой кислоты в дополнение к устранению нежелательных белков.

-Модификация белков.

-На уровне исследований, в различных исследованиях.

Преимущества протеиназы К

Было проведено несколько сравнительных исследований между методами экстракции ДНК, в которых используется протеиназа К, и другими методами, в которых она не используется, и все пришли к выводу, что использование фермента дает больше преимуществ. К преимуществам можно отнести следующее:

-Получена высокомолекулярная ДНК высокого качества и чистоты.

-Извлеченная ДНК стабильна до 3 месяцев.

Экстрагированная ДНК может быть использована в следующих методах: Саузерн-блоттинг, полимеразная цепная реакция (ПЦР), электрофорез и другие.

Белки, устойчивые к протеиназе К

Различные исследования пришли к выводу, что прионы (аномальные токсичные белки PrPSc) отличаются от белков PrPC (нативных) тем, что они устойчивы к действию протеиназы K, в то время как PrPC чувствительны к ее действию.

Другие авторы описали, что в структуре PrPSc есть чувствительные части и другие, устойчивые к протеиназе К. Однако обе части одинаково токсичны и заразны.

С другой стороны, Бастиан и др. В 1987 г. выделили 4 белка размером 28, 30, 66 и 76 кДа из вида Spiroplasma mirum. Было обнаружено, что все они устойчивы к действию протеиназы К, а также имеют перекрестную реакцию с некоторыми прионами.

Известно, что этот вид может вызывать катаракту и серьезные неврологические нарушения, и благодаря научным открытиям Бастьяна, среди других исследований, была сделана попытка связать этот микроорганизм с заразной губчатой ​​энцефалопатией.

Тем не менее, этиологию этой дегенеративной неврологической патологии продолжают приписывать прионам.

В этом смысле Батлер и др. В 1991 г. идентифицировали и охарактеризовали класс белков, устойчивых к протеиназе К, мощностью 40 кДа из двух штаммов Mycoplasma hyorhinis. Этот патоген поражает свиней, заражая их ткани, но в этом случае не было перекрестной реакции с тестируемыми прионами.

Требуются дополнительные исследования, чтобы прояснить многие неизвестные в этом отношении.

Ссылки

1. Бастиан Ф., Дженнингс Р. и Гарднер В. 1987. Антисыворотка к белку фибрилл, ассоциированным со скрепи, перекрестно реагирует с белками фибрилл Spiroplasma mirum. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Оценка метода выделения и очистки ДНК из фиксированной формальдегидом мышечной ткани неопознанных трупов. Журнал Med, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Батлер Г., Котани Х., Конг Л., Фрик М., Эванчо С., Стэнбридж Е. и Макгаррити Г. Идентификация и характеристика белков, устойчивых к протеиназе К, у представителей класса Mollicutes. Инфекция и иммунитет, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. Лопес М., Ривера М., Виеттри М., Ларес М., Марокоима А., Эррера Л. и др. Сравнение двух протоколов экстракции ДНК Trypanosoma cruzi, выращенных в аксенической среде. Преподобный Перу. Мед. Опыт общественного здравоохранения, 2014 г .; 31 (2): 222-227. Доступно на: scielo.org
5. Хименес Г., Вильялобос М., Хименес Э. и Пальма В. Определение эффективности пяти протоколов экстракции ДНК из парафинированного материала для молекулярных исследований. Преподобный Мед Univ Коста-Рика. 2007; 1 (1): 10-19.