ЦИТОХИМИЯ: ИСТОРИЯ, ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ, ПРИМЕНЕНИЕ И МЕТОДИКИ - БИОЛОГИЯ - 2025

Цитохимия включает в себя ряд методов , которые основаны на идентификации и расположении конкретных веществ внутри клетки. Он считается разделом клеточной биологии, который сочетает морфологию клетки с химической структурой.

По словам Бенсли, основателя приложения современной цитологии, он заявляет, что цель цитохимии - открыть химическую организацию клеток, чтобы понять загадки жизни. А также изучение динамических изменений, которые происходят на разных функциональных этапах.

1: экстрамаммарная болезнь Педжета. (Гематоксилин-эозин) 2: старческие бляшки, наблюдаемые в коре головного мозга у пациента с болезнью Альцгеймера. (Серебряная пропитка) 3: язык кролика, волокна коллагена (синие). Мышечные волокна (фиолетовые полоски). (Трихром Массона). 4: Ткань печени с жировым перерождением. (Судан III) 5: Воспаленная печень. Некроз. (Толуидиновый синий) Источники: Википедия. ru / Пользователь: KGH / Файлы общественного достояния / Мохит Лалвани

Таким образом, можно определить метаболическую роль этих веществ в клетке.

В цитохимии используются два основных метода. Первый основан на химических и физических процедурах. Эти методы используют микроскоп как незаменимый инструмент для визуализации химических реакций, происходящих с конкретными веществами внутри клетки.

Пример: использование цитохимических красителей, таких как реакция Фельгена или реакция PAS, среди других.

Второй метод основан на биохимии и микрохимии. С помощью этой методики можно количественно определить наличие внутриклеточных химических веществ.

Среди веществ, которые могут быть обнаружены в структуре ткани или клетки, следующие: белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и липиды.

История цитохимии

Цитохимические методы с момента их изобретения помогли понять состав клеток, и со временем появилось множество методов, в которых используются различные типы красителей с разным сродством и базовыми свойствами.

Впоследствии цитохимия открыла новые горизонты с использованием определенных субстратов, чтобы колориметрически показать присутствие ферментов или других молекул внутри клетки.

Точно так же появились другие методы, такие как иммуноцитохимия, которые очень помогли в диагностике многих заболеваний. Иммуноцитохимия основана на реакциях антиген-антитело.

С другой стороны, цитохимия также использовала флуоресцентные вещества, называемые флуорохромами, которые являются отличными маркерами для обнаружения определенных клеточных структур. Благодаря характеристикам флуорохрома он выделяет структуры, к которым он прикреплен.

Что ты изучаешь?

У различных цитохимических методов, используемых на биологическом образце, есть кое-что общее: они выявляют присутствие определенного типа вещества и знают его местоположение в оцениваемой биологической структуре, будь то тип клетки или ткань.

Эти вещества могут быть ферментами, тяжелыми металлами, липидами, гликогеном и определенными химическими группами (альдегиды, тирозин и т. Д.).

Информация, предоставленная этими методами, может служить руководством не только для идентификации клеток, но и для диагностики различных патологий.

Например, цитохимические красители очень полезны для различения различных типов лейкозов, поскольку одни клетки экспрессируют определенные ферменты или ключевые вещества, а другие нет.

С другой стороны, следует отметить, что для того, чтобы использование цитохимии было возможным, необходимо учитывать следующие соображения:

1) Вещество необходимо иммобилизовать в том месте, где оно встречается в природе.

2) Вещество должно быть идентифицировано с использованием субстратов, которые конкретно реагируют с ним, а не с другими соединениями.

Утилита

С помощью цитохимических методов можно изучить следующие образцы:

- Увеличенная периферическая кровь.

- Расширенный костный мозг.

- Ткани, фиксированные для гистохимических методов.

- Клетки фиксируются цитоцентрифугированием.

Цитохимические методы очень полезны в области гематологии, поскольку они широко используются для помощи в диагностике и дифференциации определенных типов лейкозов.

Например: реакции эстеразы используются для дифференциации миеломоноцитарного лейкоза от острого моноцитарного лейкоза.

Мазки костного мозга и периферической крови этих пациентов схожи, поскольку некоторые клетки сложно идентифицировать морфологически отдельно. Для этого проводится эстеразный тест.

В первом случае специфические эстеразы положительны, а во втором - неспецифические эстеразы.

Они также очень полезны в гистологии, так как, например, использование метода окрашивания тяжелыми металлами (импрегнация серебром) окрашивает ретикулярные волокна интенсивного коричневого цвета в ткани миокарда.

Методы цитохимии

Наиболее часто используемые методы будут объяснены ниже:

- Использование красителей

Используемые в цитохимических методах окраски очень разнообразны, и их можно классифицировать по нескольким точкам зрения:

По радикалу, к которому они имеют сродство

Они делятся на: кислые, основные или нейтральные. Они являются самыми простыми и наиболее часто используемыми на протяжении всей истории, что позволяет нам отличать базофильные компоненты от ацидофильных. Пример: окрашивание гематоксилин-эозином.

В этом случае ядра клеток окрашиваются в синий цвет (они принимают гематоксилин, который является основным красителем), а цитоплазмы - красным (они принимают эозин, который является кислотным красителем).

В зависимости от цвета, который они предоставляют

Они могут быть ортохроматическими или метахроматическими. Ортохроматические - это те, которые окрашивают структуры в тот же цвет, что и краситель. Например, в случае с эозином, который имеет красный цвет и оставляет красные пятна.

С другой стороны, метахроматические вещества окрашивают структуры в цвет, отличный от их, например, толуидин, который имеет синий цвет, но остается фиолетовым.

Витальные или суправитальные красители

Это безвредные красители, то есть они окрашивают клетки и остаются живыми. Эти пятна называются витальными (например, трипановым синим для окрашивания макрофагов) или суправитальными (например, зеленым янусом для окрашивания митохондрий или нейтральным красным для окрашивания лизосом).

- Обнаружение липидов с помощью жирорастворимых красителей

Четырехокись осмия

Окрашивает липиды (ненасыщенные жирные кислоты) в черный цвет. Эту реакцию можно наблюдать с помощью светового микроскопа, но поскольку этот краситель имеет высокую плотность, его также можно визуализировать с помощью электронного микроскопа.

Судан III

Это один из самых используемых. Этот краситель диффундирует и растворяется в тканях, накапливаясь внутри липидных капель. Цвет алый красный.

Судан черное пятно B

Он дает лучший контраст, чем предыдущие, поскольку способен растворяться также в фосфолипидах и холестерине. Это полезно для обнаружения азурофильных и специфических гранул зрелых гранулоцитов и их предшественников. Следовательно, он определяет миелоидные лейкозы.

- Окрашивание альдегидными группами (окрашивание по Шиффу периодной кислотой)

Окраска Шиффа с иодовой кислотой позволяет обнаружить три типа альдегидных групп. Они есть:

- Свободные альдегиды, естественно присутствующие в тканях (плазменная реакция).

- Альдегиды, образующиеся путем селективного окисления (реакция ПАВ).

- Альдегиды, образующиеся при селективном гидролизе (реакция Фельгена).

PAS реакция

Это окрашивание основано на обнаружении определенных типов углеводов, таких как гликоген. Периодическая кислота Шиффа разрывает CC-связи углеводов из-за окисления гликолевых групп 1-2, способствуя высвобождению альдегидных групп.

Свободные альдегидные группы реагируют с реактивом Шиффа и образуют пурпурно-красное соединение. Появление пурпурно-красного цвета свидетельствует о положительной реакции.

Этот тест положительный в растительных клетках, обнаруживая крахмал, целлюлозу, гемицеллюлозу и пептины. Находясь в клетках животных, он обнаруживает муцины, мукопротеины, гиалуроновую кислоту и хитин.

Кроме того, он полезен при диагностике лимфобластных лейкозов или эритролейкозов, среди других патологий миелодиспластического типа.

В случае кислых углеводов можно использовать краситель альциановый синий. Тест считается положительным, если наблюдается светло-голубой / бирюзовый цвет.

Плазменная реакция

Плазменная реакция выявляет присутствие определенных длинноцепочечных алифатических альдегидов, таких как пальмовый и стеаральный. Этот метод применяется на замороженных гистологических срезах. Его обрабатывают непосредственно реактивом Шиффа.

Реакция Фельгена

Этот метод обнаруживает присутствие ДНК. Техника состоит в том, чтобы подвергнуть фиксированную ткань гидролизу слабой кислотой, чтобы впоследствии заставить ее прореагировать с реактивом Шиффа.

Гидролиз обнажает дезоксирибозные альдегидные группы на дезоксирибозно-пуриновой связи. Затем реактив Шиффа вступает в реакцию с оставшимися свободными альдегидными группами.

Эта реакция положительна в ядрах и отрицательна в цитоплазме клеток. О положительности свидетельствует наличие красного цвета.

Если этот метод сочетается с метиловым зеленым пиронином, можно одновременно обнаруживать ДНК и РНК.

- Цитохимические окрашивания белковых структур

Для этого можно использовать реакцию Миллона, в которой в качестве реагента используется нитрат ртути. Структуры, содержащие ароматические аминокислоты, окрашиваются в красный цвет.

- Цитохимические красители, использующие субстраты, чтобы показать присутствие ферментов

Эти пятна основаны на инкубации биологического образца с определенным субстратом, и продукт реакции впоследствии вступает в реакцию с диазосолями с образованием окрашенного комплекса.

Эстеразы

Эти ферменты присутствуют в лизосомах некоторых клеток крови и способны гидролизовать сложные органические эфиры с высвобождением нафтола. Последний образует нерастворимый азокраситель, когда он связывается с диазосолью, окрашивая место, где происходит реакция.

Существует несколько субстратов, и в зависимости от того, какой из них используется, можно идентифицировать специфические эстеразы и неспецифические эстеразы. Первые присутствуют в незрелых клетках миелоидного ряда, а вторые - в клетках моноцитарного происхождения.

Субстрат, используемый для определения специфических эстераз, представляет собой хлорацетат нафтола-AS-D. Хотя для определения неспецифических эстераз можно использовать несколько субстратов, таких как ацетат нафтола AS-D, альфа-нафтилацетат и альфа-нафтилбутират.

В обоих случаях клетки окрашиваются в темно-красный цвет при положительной реакции.

миелопероксидазы

Этот фермент содержится в азурофильных гранулах гранулоцитарных клеток и моноцитов.

Его обнаружение используется для дифференциации лейкозов миелоидного происхождения от лимфоидных. Клетки, содержащие миелопероксидазы, приобретают охристо-желтый цвет.

Фосфатазы

Эти ферменты высвобождают фосфорные кислоты из разных субстратов. Они отличаются друг от друга специфичностью субстрата, pH и действием ингибиторов и инактиваторов.

Среди наиболее известных - фосфомоноэстеразы, гидролизующие простые эфиры (ПО). Пример: щелочная фосфатаза и кислая фосфатаза, а также фосфамидазы, гидролизующие связи (PN). Они используются для дифференциации лимфопролиферативных синдромов и для диагностики волосатоклеточного лейкоза.

- Трихромная окраска

Маллари-Азан Трихром

Они полезны для дифференциации цитоплазмы клеток от волокон соединительной ткани. Клетки окрашивают в красный цвет, а волокна коллагена - в синий.

Трихром Массона

Он имеет ту же полезность, что и предыдущий, но в этом случае клетки окрашиваются в красный цвет, а волокна коллагена - в зеленый.

- Красители, окрашивающие определенные органеллы

Янус Грин

Он выборочно окрашивает митохондрии.

Соли серебра и осмиевая кислота

Пятна на аппарате Гольджи.

Толуидиновый синий

Окрашивает тела Нисси

Соли серебра и ПАВ

Они окрашивают ретикулярные волокна и базальную пластинку.

Орсеин и фуксин резорцин

Окрашивают эластичные волокна. У первого они окрашены в коричневый цвет, а у второго - в темно-синий или фиолетовый.

- Другие методы, используемые в цитохимии

Использование флуоресцентных веществ или флуорохромов

Существуют методы, использующие флуоресцентные вещества для изучения расположения структуры в клетке. Эти реакции визуализируются с помощью специального микроскопа, называемого флуоресцентным. Пример: метод IFI (непрямая иммунофлуоресценция).

Обнаружение клеточных компонентов иммуноцитохимическим методом

Эти методы очень полезны в медицине, поскольку они помогают обнаружить определенную клеточную структуру, а также количественно ее оценить. Эта реакция основана на реакции антиген-антитело. Например: методы ELISA (иммуноферментный анализ).

рекомендации

- Необходимо использовать контрольные мазки для оценки хороших характеристик красителей.

- Для цитохимического окрашивания следует использовать свежие мазки. Если это невозможно, их следует хранить в защищенном от света месте при температуре 4 ° C.

- Необходимо следить за тем, чтобы используемый фиксатор не оказывал отрицательного воздействия на исследуемое вещество. Другими словами, необходимо предотвратить его извлечение или подавление.

- Необходимо соблюдать время использования фиксаторов, так как обычно оно должно длиться всего несколько секунд, так как более длительное воздействие фиксатора на мазок может повредить некоторые ферменты.

Ссылки

1. «Цитохимия.» Википедия, свободная энциклопедия. 30 июня 2018 г., 17:34 UTC. 9 Июл 2019, 02:53 Доступно на: wikipedia.org
2. Вильярроэль П., де Суарес К. Методы металлической импрегнации для исследования ретикулярных волокон миокарда: сравнительное исследование. RFM 2002; 25 (2): 224-230. Доступно на: scielo.org
3. Сантана А., Лемес А., Боланьос Б., Парра А., Мартин М., Молеро Т. Цитохимия кислой фосфатазы: методологические соображения. Rev Diagn Biol.200; 50 (2): 89-92. Доступно на: scielo.org
4. Де Робертис Э., Де Робертис М. (1986). Клеточная и молекулярная биология. 11-е издание. От редакции Ateneo. Буэнос-Айрес, Аргентина.
5. Классические инструменты для изучения клеточной биологии. ТП 1 (дополнительный материал) - Клеточная биология. Доступно на: dbbe.fcen.uba.ar