ОКСИДАЗНЫЙ ТЕСТ: ОБОСНОВАНИЕ, ПРОЦЕДУРА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ - БИОЛОГИЯ - 2025

Тест - оксидаза является диагностическим методом , который показывает наличие фермента комплекса называется цитохром оксидазы с. Эта система вызывает преобразование восстановленного цитохрома в окисленный, поскольку он захватывает кислород, который, в свою очередь, действует как последний акцептор электронов (H ⁺ ) в дыхательной цепи.

Термин оксидаза - это сокращенное обозначение фермента цитохромоксидазы, также известного как индофенолоксидаза. В древние времена считалось, что цитохромоксидаза и индофенолоксидаза - это два разных фермента, но сегодня они известны как одно и то же.

Положительный и отрицательный оксидазный тест. Источник: Машиночитаемый автор не предоставлен. Предполагается, что Alpha.prim ~ commonswiki (на основании заявлений об авторских правах).

Со своей стороны, цитохромы представляют собой гемопротеины, содержащие железо и завершающие систему цитохромоксидазы. Цитохромы могут варьироваться от вида к виду.

Существуют разные разновидности цитохромов (цитохромы a1, a2, a3 и 0). Некоторые бактерии могут производить только один, а другие до двух или трех одновременно. В этом смысле присутствие цитохрома а и а3 известно как цитохромоксидаза с. Это тип цитохрома, который обнаруживает оксидазный тест.

Роды Neisseria и Pseudomonas содержат цитохромоксидазу c. Эти роды дают положительный тест на оксидазу, помогая дифференцировать их от родов Acinetobacter и Stenotrophomonas соответственно.

Есть также другие роды, которые положительны на оксидазу.

основа

Характеристики системы цитохромоксидазы с

Система цитохромоксидазы c работает следующим образом: оксидаза-положительные микроорганизмы используют кислород для выработки энергии посредством аэробного дыхания. Эта система работает благодаря переносу электронов от донорных веществ, таких как НАДН ^+, к веществам-рецепторам, в данном случае к кислороду.

Это приводит к выработке энергии (АТФ) и воды или перекиси водорода, в зависимости от системы цитохромоксидазы, которой обладает микроорганизм.

Вот почему большинство оксидазоположительных бактерий также являются каталазоположительными, что является необходимым условием для устранения производимой перекиси водорода, поскольку это вещество токсично для бактерий.

Система цитохромоксидазы с присутствует в некоторых аэробных бактериях, некоторых факультативных анаэробах, небольшом количестве микроаэрофильных и не является строгими анаэробами. Последнее понятно, поскольку строгие анаэробы не могут жить в присутствии кислорода, поэтому у них отсутствует система цитохромоксидазы.

Принцип испытания

В этом тесте используются вещества, которые действуют как искусственные акцепторы электронов, заменяя природные в цепи переноса электронов.

В основном используются красители, такие как парафенилендиамин и индофенол, которые действуют как субстраты рецепторов и искусственные доноры электронов.

Парафенилендиамин окисляется системой цитохромоксидазы c. Краситель в восстановленной форме бесцветен, но в окисленной форме окрашен.

Таким образом подтверждается наличие системы цитохромоксидазы c; так как положительная реакция приведет к появлению бледно-лилового или сине-пурпурного цвета в зависимости от используемого реагента.

С другой стороны, если последнее электроноакцепторное вещество в дыхательной цепи отличается от кислорода, тест на оксидазу будет отрицательным (цветное образование отсутствует); это случай с анаэробными микроорганизмами.

Аналогичным образом, если цитохром, используемый микроорганизмом, отличается от цитохромоксидазы c, он также даст отрицательный результат.

Обработать

Существуют различные реагенты и протоколы для теста на оксидазу, все для той же цели.

Реагенты

Реагент Ковача, реагент Гордона и МакЛеода, реагент Нади, реагент Карпентера, Зурланда и Моррисона, а также использование оксидазных дисков.

-Реагент Ковача оксидазы

Он состоит из 1% дигидрохлорида тетраметил-п-фенилендиамина.

Реагент Ковача получают растворением 1 г указанного выше вещества в 50 мл дистиллированной воды. Его слегка нагревают до полного растворения. Перелейте в желтую бутылку достаточной емкости и доведите объем до 100 мл дистиллированной водой. Подождите не менее 15 минут перед использованием. Хранить в защищенном от света холодильнике.

Он помечен как «реагент Ковача-оксидаза», чтобы отличить его от реагента Ковача, используемого для выявления индольного теста. Этот реагент наиболее чувствительный, менее токсичный, но более дорогой, чем остальные реагенты.

При использовании этого реагента будет подтверждена положительная реакция: цвет колонии изменится на бледно-лиловый, который быстро станет пурпурным почти черным. Отрицательная реакция очевидна, потому что колония не меняет цвет или приобретает легкий розоватый оттенок. Среда также может потемнеть, но это не означает положительной реакции.

С этим реагентом время реакции имеет решающее значение, изменение цвета, которое происходит от 5 до 15 секунд, считается положительной реакцией.

-Реагент Гордона и МакЛеода

Он состоит из дигидрохлорида диметил-п-фенилендиамина, также известного как N-диметил-п-фенилендиамин или моногидрохлорид п-аминодиметиланилина. Он готовится, как описано для реагента Ковача-оксидазы, вместо соответствующего вещества.

Этот реагент немного более стабилен, чем реагент Ковача-оксидазы, хотя все реагенты, содержащие п-фенилендиамин, нестабильны.

Эта реакция позже интерпретируется как положительная с появлением сине-фиолетового цвета в течение 10-30 минут.

-Реагент Нади

Он состоит из 1% α-нафтола в этиловом спирте (95% этанола) и 1% аминодиметиланилина. Смесь готовят в равных частях с использованием абсолютного этилового спирта в качестве разбавителя до получения достаточного количества для 100 мл.

-Реагент Карпентера, Зурланда и Моррисона

Он состоит из 1% оксалата п-аминодиметилаланина. Готовят так же, как описано для реагента Ковача для оксидазы, заменяя соответствующее вещество.

Когда раствор готов, тест-полоски готовят следующим образом: полоски фильтровальной бумаги Whatman № 1 толщиной 6-8 см пропитывают 1% -ным диметил-п-фенилендиаминоксалатным реагентом.

Их оставляют сохнуть без контакта с металлом, хранят в банках с завинчивающейся крышкой с осушителем и хранят в холодильнике. Эти полоски стабильны до 6 месяцев.

Это самый стабильный реагент из всех упомянутых, и может храниться в растворе до 6 месяцев. Еще одним плюсом является то, что он не окрашивает среду вокруг колонии, если использовать ее непосредственно на планшете.

Появление красного цвета трактуется как положительный тест.

-Оксидазные диски

Это коммерческие диски, пропитанные реагентом для оксидазного теста. На рынке представлено несколько коммерческих брендов.

Его использование довольно практично, так как не нужно готовить свежие реагенты, что облегчает работу. Полученные результаты надежны, если диски хранятся должным образом.

протоколы

Прямой пластинчатый метод, непрямой метод на бумаге и использование дисков, пропитанных оксидазными реагентами.

-Метод прямой платы

Для этого добавляют 2 или 3 капли любого из вышеупомянутых реагентов непосредственно на колонии, содержащиеся в чашке с питательной средой, не содержащей глюкозу.

Интерпретируют изменение или отсутствие цвета колоний, а не среды. Допустимое время реакции зависит от используемого реагента.

-Прямой метод на бумаге

Отрежьте кусок фильтровальной бумаги (Ватман № 1) размером 6 см ² и поместите его в пустую чашку Петри.

Добавьте 2 или 3 капли реактива оксидазы Ковача на бумагу, возьмите часть исследуемой колонии с помощью платиновой ручки или деревянной зубочистки и нанесите ее по прямой линии на пропитанную реактивом бумагу. Переводите в течение 5–10 секунд.

С помощью полосок, приготовленных с реактивами Карпентера, Зурланда и Моррисона, колония распределяется по сухой полосе. Одна полоска используется для тестирования нескольких штаммов. Устный перевод за 10 сек.

-Диски (м

Слегка смочите коммерческие диски стерильной дистиллированной водой и нанесите на исследуемую колонию. Рекомендуется использовать чашки при 35 ° C, если используются чашки с комнатной температурой или охлаждаемые чашки, реакция протекает немного медленнее. Интерпретируйте изменение цвета от 10 до 20 секунд.

Могут быть использованы колонии, содержащиеся на кровяном или шоколадном агаре.

-Диски (косвенный метод)

Смочите диск, как описано ранее. Поместите его в пустую чашку Петри. Возьмите достаточное количество колонии для изучения с помощью платиновой ручки или деревянной зубочистки и поместите на диск. Интерпретируйте изменение цвета от 10 до 20 секунд.

использование

Род Neisseria и Acinetobacter иногда очень похожи морфологически, потому что, хотя род Acinetobacter является грамотрицательной палочкой, иногда он может принимать кокковидную форму и распределяться парами, имитируя род Neisseria.

В этом случае действительно полезен оксидазный тест. Род Neisseria положительный, а Acinetobacter отрицательный.

Однако род Moraxella очень похож на род Neisseria, и оба дают положительную реакцию; Вот почему для окончательной идентификации всегда необходимо проводить тесты на ферментацию углеводов.

С другой стороны, оксидазный тест полезен для дифференциации бактерий, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae (все отрицательные на оксидазу), от других ферментеров, таких как представители рода Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (положительные по оксидазе).

Род Vibrio и Helicobacter также являются оксидазоположительными.

QA

Используйте известные штаммы Escherichia coli в качестве отрицательного контроля и штаммы Pseudomonas aeruginosa в качестве положительного контроля.

Ограничения

-Реагенты должны использоваться свежеприготовленными, их срок хранения в растворе при комнатной температуре короткий, потому что они очень нестабильны. В холодильнике они могут храниться от 5 дней до 2 недель.

-Реагенты бесцветные, если они меняют цвет, их необходимо выбросить. Поврежденные диски обнаруживаются, потому что со временем они темнеют.

-Положительная реакция с реактивом Ковача-оксидазы между 15-60 секундами считается отложенной реакцией, а после 60 секунд - отрицательной.

-Haemophylus influenzae дает отрицательную оксидазную реакцию, если используется какой-либо реагент с диметил-п-фенилендиамином, но положительную, если используется реактив оксидазы Ковача (тетраметил-п-фенилендиамин).

- Среды, содержащие глюкозу, мешают проведению теста, давая ложноотрицательные результаты.

-Штаммы Bordetella pertussis могут давать ложноположительную реакцию, если они происходят из чашек с высококонцентрированным кровяным агаром.

-Использование металлических (железных) ручек дает ложноположительную реакцию.

рекомендации

-Поскольку реагенты очень нестабильны и склонны к самоокислению, рекомендуется заморозить аликвоты от 1 до 2 мл и удалить при необходимости.

-Еще один способ замедлить автоокисление реагента - добавить 0,1% аскорбиновую кислоту при приготовлении реагентов.

-Поскольку реагенты нестабильны, рекомендуется еженедельный контроль качества.

-Реагенты, не прошедшие проверку качества, использовать нельзя.

Ссылки

1. Конеман Э, Аллен С., Джанда В., Шрекенбергер П., Винн В. (2004). Микробиологическая диагностика. 5-е изд. Редакция Panamericana SA Аргентина.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Микробиологический диагноз Бейли и Скотта. 12 изд. Редакция Panamericana SA Аргентина.
3. «Оксидазный тест». Википедия, свободная энциклопедия. 15 января 2018 г., 10:32 UTC. 3 апреля 2019, 14:03
4. Всемирная организация здравоохранения. Лабораторное руководство по идентификации и тестированию чувствительности к противомикробным препаратам бактериальных патогенов, важных для общественного здравоохранения в развивающихся странах. 2004. Доступно по адресу: who.int/drugresistance/infosharing
5. Полоски с реагентами для диагностики активности оксидазы у бактерий. Rev Cubana Med Trop. 2000; 52 (2): 150-151.