КАТАЛАЗНЫЙ ТЕСТ: ОБОСНОВАНИЕ, МЕТОДИКА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ - БИОЛОГИЯ - 2025

Тест на каталазу - это методика, используемая в бактериологических лабораториях, чтобы показать присутствие фермента каталазы в тех бактериях, которые им обладают. Вместе с окраской по Граму они являются основными тестами, которые следует проводить на недавно выделенных микроорганизмах. Эти тесты направляют микробиолога на шаги, которые необходимо выполнить для окончательной идентификации рассматриваемого микроорганизма.

Как правило, бактерии, содержащие цитохром, обладают ферментом каталазой, что означает, что факультативные аэробные и анаэробные бактерии должны обладать им. Однако есть исключения, такие как Streptococcus, которые, несмотря на то, что они являются факультативными анаэробными микроорганизмами, не обладают ферментом каталазой.

Запуск теста на каталазу, показывающий положительную реакцию. Источник: Машиночитаемый автор не предоставлен. Предполагается Nase (на основании заявлений об авторских правах).

Вот почему тест на каталазу используется в первую очередь для различения семейств Staphylococaceae и Micrococaceae (оба положительные по каталазе) от семейства Streptococaceae (отрицательные по каталазе).

Аналогичным образом, род Bacillus (положительный по каталазе) отличается, среди прочего, от рода Clostridium (отрицательный по каталазе).

основа

Каталаза - это фермент, классифицируемый как гидропероксидаза, это означает, что они используют перекись водорода (H ₂ O ₂ ) в качестве субстрата .

Он также считается оксидоредуктазой, поскольку в реакции, в которой он участвует, присутствует элемент, который служит донором электронов (восстанавливающее вещество), а другой - рецептором электронов (окисляющее вещество).

Каталаза - это белок, содержащий прозерическую группу с четырьмя атомами трехвалентного железа (Fe ⁺⁺⁺ ), следовательно, это гомопротеин. Ион трехвалентного железа остается окисленным во время реакции.

Можно сказать, что каталаза является детоксифицирующим ферментом, поскольку ее функция заключается в устранении токсичных для бактерий веществ, которые вырабатываются в процессе метаболизма бактерий. Среди этих веществ - перекись водорода.

Перекись водорода образуется при аэробном расщеплении сахаров. Этот процесс происходит следующим образом:

Ион супероксида (O ₂ ^- ) (свободный радикал) образуется как конечный продукт ассимиляции глюкозы аэробным путем. Он токсичен и устраняется ферментом супероксиддисмутазой, который превращает его в газообразный кислород и перекись водорода.

Перекись водорода также токсична для бактерий и должна быть удалена. Фермент каталаза расщепляет перекись водорода на воду и кислород.

Каталаза может действовать на субстраты, отличные от перекиси водорода, такие как спирты, альдегиды, кислоты, ароматические амины и фенолы. Однако перекись водорода также может использоваться каталазой для окисления других токсичных соединений, таких как метиловый и этиловый спирт.

Точно так же каталаза присутствует в фагоцитирующих клетках, защищая их от токсического действия перекиси водорода.

Обычная методика теста на каталазу

-Слайд метод

материалы

3% перекись водорода (10 объемов).

Предметное стекло микроскопа

Одноразовая пластиковая ручка или деревянная зубочистка.

Обработать

Возьмите достаточное количество колонии для изучения, не касаясь агара, из которого она произошла. Колония должна быть свежей, то есть из культуры от 18 до 24 часов.

Поместите колонию на сухое предметное стекло и добавьте к нему каплю 3% перекиси водорода (также можно использовать 30% H ₂ O ₂ ). Немедленно наблюдайте, выходят ли пузырьки.

интерпретация

Положительная реакция: выделение газа, о чем свидетельствует образование пузырьков (сильное пузырение).

Отрицательная реакция: пузырьков нет.

-Прямой метод в чистой культуре

Поместите 1 мл 3% H ₂ O ₂ на чистую чашку или клиновидную культуру, не содержащую крови (предпочтительно питательный агар). Сразу же обратите внимание на образование пузырьков. Также можно использовать 30% H ₂ O ₂ .

Он интерпретируется так же, как метод объекта порта.

-Метод с капиллярной трубкой или по Фунгу и Петришко

Заполните капиллярную трубку 67 мм на высоту 20 мм 3% перекисью водорода капиллярно.

Коснитесь изолированной колонии для исследования с капилляром, заполненным 3% H ₂ O _{2 .} Убедитесь, что капилляр заполняется пузырьками примерно через 10 секунд. Этот метод позволяет полуколичественно определить реакцию крестиками:

Без крестиков нет пузырей (реакция отрицательная).

+ ---- Мало пузырей (слабая или замедленная реакция).

++ --– Обильные пузыри (умеренная реакция).

+++ - Пузыри достигают противоположного конца (сильная реакция).

-Метод Тейлора и Аханзара для тестов каталазы, которые дают сомнительные

Поместите изолированную колонию на чистое сухое предметное стекло, затем поместите каплю 0,5% H ₂ O ₂ и накройте покровным стеклом. Обратите внимание на образование пузырьков в ловушке.

Толкование: наличие пузырьков свидетельствует о положительной реакции. Нет пузырей, это интерпретируется как отрицательная реакция.

Каталазный тест на виды Mycobacterium

Эту технику необходимо выполнять, контролируя pH и температуру. Его необходимо проводить под ламинарным вытяжным шкафом, поскольку манипулирование различными видами Mycobacterium опасно.

-Материалы

Перекись водорода 30% или 110 объемов (супероксаль).

Фосфатный буфер pH 7

10% Твин 80

Культивирование микобактерий клин в течение 3-4 недель

-Подготовка

Фосфатный буфер pH 7

Весить:

1,361 г безводного монофосфата калия (KH ₂ PO ₄ ).

1,420 г безводного динатрия (Na2HPO3) фосфата.

Растворите обе соли в небольшом количестве стерильной дистиллированной воды и долейте водой до 1000 мл.

10% Твин 80

Сделайте раствор 1:10 коммерчески концентрированного Tween 80, для этого выполните следующие действия:

Возьмите 1 мл Твина 80 и поместите его в немного дистиллированной воды, растворите и доведите объем до 10 мл водой.

Конечный реагент

Смешайте некоторое количество фосфатного буфера с 10% Tween 80 (равные части). Определите в лаборатории, сколько вы хотите приготовить.

-Обработать

Поместите 5 мл фосфатного буфера в стерильную пробирку с завинчивающейся крышкой (бакелит).

С помощью инокуляционной петли возьмите достаточное количество колоний микобактерий, посеянных клиньями, и растворите их в фосфатном буфере.

Закройте трубку, не перетягивая резьбу. Поместите на водяную баню при 68 ° C на 20–30 минут. Вынуть и дать остыть до 22-25 ° C.

Отмерьте 0,5 мл последнего реагента (смесь) и добавьте его в пробирку с холодным раствором. Обратите внимание на образование пузырей.

Интерпретируется так же, как и предыдущие приемы.

использование

Когда рост колоний достигается в обогащенной среде, на полученных колониях следует проводить окрашивание по Граму и тест на каталазу. Это поможет микробиологу определить процедуры, которым необходимо следовать для окончательной идентификации.

Источник: Подготовлено автором MSc. Мариельса Гиль

QA

Чтобы оценить хорошие характеристики реагента перекиси водорода, используйте свеже культивируемые контрольные штаммы, такие как Staphylococcus aureus в качестве положительного контроля и штаммы Streptococcus sp в качестве отрицательного контроля.

Другой альтернативой, которая служит положительным контролем, является нанесение капли перекиси водорода на кровяной агар, в эритроцитах есть каталаза, поэтому, если реагент в хорошем состоянии, будут пузыриться.

В качестве отрицательного контроля можно использовать шоколадный агар, здесь эритроциты уже лизированы и тест отрицательный.

Ограничения

-Не используйте для теста старые культуры, так как это может вызвать ложноотрицательные результаты.

-Избегайте брать колонии из культур на кровяном агаре, если вы осторожно не касаетесь агара; Эта процедура может привести к ложным срабатываниям, поскольку красные кровяные тельца содержат каталазу.

-Если вы берете колонию с платиновой ручкой, не меняйте порядок процедуры в обратном порядке, поскольку это может привести к ложным срабатываниям. Это связано с тем, что платина может реагировать с перекисью водорода, вызывая образование пузырьков.

-Не используйте реагент перекиси водорода, если он очень старый, так как реагент очень нестабилен и со временем разрушается.

-Держите реагент перекиси водорода защищенным от света и охлажденным, чтобы предотвратить повреждение.

- Выполняйте контроль качества реагента перекиси водорода каждый раз, когда он используется.

-Примите во внимание, что при использовании 30% H ₂ O ₂ реакции будут более сильными, чем реакции, проводимые с 3% H ₂ O ₂ .

Ссылки

1. Конеман Э, Аллен С., Джанда В., Шрекенбергер П., Винн В. (2004). Микробиологическая диагностика. 5-е изд. Редакция Panamericana SA Аргентина.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Микробиологический диагноз Бейли и Скотта. 12 изд. Редакция Panamericana SA Аргентина.
3. Мак Фаддин Дж. (2003). Биохимические тесты для идентификации бактерий, имеющих клиническое значение. 3-е изд. Редакция Panamericana. Буэнос айрес. Аргентина.
4. BD Laboratories. Каталаза-Готарио Реагент. Доступно на: http://winklerltda.cl
5. Vadequímica Laboratories. Перекисью. Эквивалентность объемов и процентов. Доступно на: vadequimica.com