ЭНДОНУКЛЕАЗЫ: ФУНКЦИИ, ВИДЫ И ПРИМЕРЫ - БИОЛОГИЯ - 2025

Эти эндонуклеазы представляют собой ферменты , которые разрезают фосфодиэфирные связи , расположенные в пределах нуклеотидной цепи. Сайты рестрикции эндонуклеаз очень разнообразны. Некоторые из этих ферментов разрезают ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота, наш генетический материал) практически везде, то есть они неспецифичны.

Напротив, существует другая группа эндонуклеаз, которые очень специфичны в области или последовательности, которые необходимо отщепить. Эта группа ферментов известна как рестрикционные ферменты, и они очень полезны в молекулярной биологии. В эту группу входят хорошо известные ферменты Bam HI, Eco RI и Alu I.

Эндонуклеазы разрезают ДНК изнутри.
Источник: pixabay.com

В отличие от эндонуклеаз, существует другой тип каталитических белков - экзонуклеазы, которые отвечают за разрыв фосфодиэфирных связей на конце цепи.

Эндонуклеазы рестрикции

Эндонуклеазы рестрикции или рестрикционные ферменты представляют собой каталитические белки, которые отвечают за расщепление фосфодиэфирных связей внутри цепи ДНК в очень специфических последовательностях.

Эти ферменты можно приобрести у нескольких биотехнологических компаний, и их использование практически необходимо в современных методах манипулирования ДНК.

Эндонуклеазы рестрикции названы с использованием первых букв биномиального научного названия организма, из которого они происходят, за которыми следует штамм (это необязательно) и в конце группы рестрикционных ферментов, к которым они принадлежат. Например, Bam HI и Eco RI - широко используемые эндонуклеазы.

Участок ДНК, который распознает фермент, называется сайтом рестрикции и является уникальным для каждой эндонуклеазы, хотя несколько ферментов могут совпадать в сайтах рестрикции. Этот сайт обычно состоит из короткой палиндромной последовательности длиной от 4 до 6 пар оснований, такой как AGCT (для Alu I) и GAATTC для Eco RI.

Палиндромные последовательности - это последовательности, которые, хотя читаются в направлении от 5 'до 3' или от 3 'до 5', идентичны. Например, в случае Eco RI палиндромная последовательность: GAATTC и CTTAAG.

Функции и применения эндонуклеаров рестрикции

К счастью для молекулярных биологов, в ходе эволюции бактерии разработали серию рестрикционных эндонуклеаз, которые фрагментируют генетический материал внутри.

В природе эти ферменты возникли - предположительно - как система защиты бактерий от вторжения чужеродных молекул ДНК, например, фагов.

Эти эндонуклеазы рестрикции могут распознавать специфические нуклеотидные последовательности, чтобы различать нативный и чужеродный генетический материал. Таким образом, ДНК, не имеющая этой последовательности, может не нарушаться внутри бактерий.

Напротив, когда эндонуклеаза распознает сайт рестрикции, она связывается с ДНК и разрезает ее.

Биологи заинтересованы в изучении генетического материала живых существ. Однако ДНК состоит из нескольких миллионов пар оснований в длину. Эти молекулы очень длинные и должны анализироваться небольшими фрагментами.

Для достижения этой цели эндонуклеазы рестрикции интегрированы в различные протоколы молекулярной биологии. Например, отдельный ген может быть захвачен и воспроизведен для будущего анализа. Этот процесс называется «клонированием» гена.

Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента (RFLP)

Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов относится к типу специфических нуклеотидных последовательностей в ДНК, которые рестрикционные эндонуклеазы способны распознавать и разрезать.

Благодаря специфичности ферментов каждый организм характеризуется особым разрезом в ДНК, из которого возникают фрагменты различной длины.

Типы эндонуклеаз рестрикции

Исторически рестрикционные эндонуклеазы подразделяются на три типа ферментов, обозначаемых римскими цифрами. Недавно был описан четвертый тип эндонуклеаз.

Тип I

Наиболее важной характеристикой эндонуклеаз I типа является то, что они представляют собой белки, состоящие из нескольких субъединиц. Каждая из этих функций действует как единый белковый комплекс и обычно состоит из двух субъединиц, называемых R, двух M и одной S.

Участок S отвечает за распознавание сайта рестрикции в ДНК. Субъединица R, со своей стороны, важна для расщепления, а М отвечает за катализ реакции метилирования.

Существует четыре подкатегории широко используемых ферментов типа I, известных под буквами A, B, C и D. Эта классификация основана на генетическом дополнении.

Ферменты типа I были первыми эндонуклеазами рестрикции, которые были обнаружены и очищены. Однако наиболее полезными в молекулярной биологии являются тип II, который будет описан в следующем разделе.

Тип II

Эндонуклеазы рестрикции типа II распознают специфические последовательности ДНК и расщепляют в постоянном положении, близком к последовательности, которая продуцирует 5'-фосфаты и 3'-гидроксилы. Как правило, им в качестве кофакторов требуются ионы магния (Mg ²⁺ ), но есть и такие, которые имеют гораздо более конкретные требования.

Структурно они могут представлять собой мономеры, димеры или даже тетрамеры. В рекомбинантной технологии используются эндонуклеазы II типа, по этой причине охарактеризовано более 3500 ферментов.

Тип III

Эти ферментные системы состоят из двух генов, называемых mod и res, которые кодируют субъединицы, распознающие ДНК, а также модификации или ограничения. Обе субъединицы необходимы для рестрикции, процесса, полностью зависящего от гидролиза АТФ.

Чтобы расщепить молекулу ДНК, фермент должен взаимодействовать с двумя копиями непалиндромной последовательности узнавания, и сайты должны быть в обратной ориентации на субстрате. Расщеплению предшествует транслокация ДНК.

Тип IV

В последнее время была выявлена ​​дополнительная группа. Система состоит из двух или более генов, которые кодируют белки, которые расщепляют только модифицированные последовательности ДНК, метилированные, гидроксиметилированные или гидрометилированные глюкозил.

Например, фермент EckKMcrBC распознает два динуклеотида общей формы RmC; пурин, за которым следует метилированный цитозин, который может быть разделен несколькими парами оснований - от 40 до почти 3000. Расщепление происходит примерно через 30 пар оснований после сайта, который распознает фермент.

Эндонуклеазы V типа

Эндонуклеазы этого типа также известны как эндонуклеазы «самонаведения». Эти ферменты распознают и разрезают последовательность ДНК-мишени на уникальных участках генома от 14 до 40 п.н.

Эти ферменты часто кодируются в интронах, и предполагается, что их функция заключается в обеспечении горизонтального переноса разрезанных последовательностей. После разрезания в двойной спирали ДНК происходит восстановление разрыва на основе комплементарной последовательности.

Примеры

Эндонуклеаза I из E. coli действует как система защиты от фагов и паразитов. Он расположен в основном между цитоплазматической мембраной и клеточной стенкой. Он вызывает двухцепочечные разрывы в чужеродной ДНК, с которой взаимодействует в периплазматическом пространстве.

Эндонуклеазы CRISPR-Cas - это ферменты, которые действуют на защитные механизмы многих типов бактерий. Они идентифицируют и отсекают определенные последовательности ДНК от вторгшихся организмов, которые обычно являются вирусами.

Недавно исследователи из Массачусетского технологического института (MIT) обнаружили систему редактирования генома CRISPR-Cas12bm с высокой точностью для модификации человеческих клеток.

Ссылки

1. Баррелл, ММ (ред.). (1993). Ферменты молекулярной биологии. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press.
2. Лоенен, Вашингтон, Драйден, Д.Т., Роли, Э.А., и Уилсон, Г.Г. (2013). Рестрикционные ферменты I типа и их родственники. Исследование нуклеиновых кислот, 42 (1), 20-44.
3. Мюррей, PR, Розенталь, Канзас, и Пфаллер, Массачусетс (2017). Медицинская микробиология + Консультация студента на испанском языке + Консультация студента. Elsevier Health Sciences.
4. Натанс Д. и Смит Х.О. (1975). Эндонуклеазы рестрикции в анализе и реструктуризации молекул ДНК. Ежегодный обзор биохимии, 44 (1), 273-293.
5. Пингоуд А., Фуксрайтер М., Пингоуд В. и Венде В. (2005). Эндонуклеазы рестрикции II типа: структура и механизм. Клеточные и молекулярные науки о жизни, 62 (6), 685.