ФОСФАТНЫЙ БУФЕР (PBS): ОБОСНОВАНИЕ, ПОДГОТОВКА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ - БИОЛОГИЯ - 2025

Фосфатный буфер, фосфатный буферный солевой раствор или БПС представляет собой буфер изотонического, функция которого является , чтобы поддерживать рН и осмотическое давление , как можно ближе к естественной биологической среде (физиологической). Аббревиатура PBS означает физиологический раствор с фосфатным буфером.

PH и осмолярность - два очень важных аспекта, которые необходимо контролировать в определенных лабораторных протоколах. В случае pH важно, чтобы его контролировали, особенно в биохимических реакциях, поскольку они могут изменяться или не проводиться, если реагенты имеют неподходящий pH.

Забуференный фосфатом физиологический раствор PBS при двух различных значениях pH. Источник: Pixinio.com

Между тем, контроль осмолярности очень важен, особенно при работе с живыми клетками, поскольку плазматические мембраны клеток реагируют в соответствии с концентрацией растворенных веществ, в которых они находятся.

Если клетки переносятся в гипертоническую среду, они становятся обезвоженными, поскольку водный градиент переносится в сторону с более высокой концентрацией растворенных веществ. Если, с другой стороны, клетки помещают в гипотоническую среду, клетки будут поглощать жидкость до тех пор, пока они не будут лизированы.

Вот почему буфер PBS используется для лабораторных протоколов, которые требуют поддержания клеток in vitro, таким образом клетки не будут повреждены.

PBS состоит из комбинации солей, таких как хлорид натрия, фосфат натрия, хлорид калия и фосфат калия. Состав PBS может варьироваться в зависимости от протокола.

основа

В основном функция фосфатного буфера заключается в поддержании постоянного физиологического pH вместе с концентрацией электролита, аналогичной той, которая обнаруживается внутри тела.

В этой среде клетки могут оставаться стабильными, поскольку физиологические условия максимально имитируются.

При необходимости к исходному составу PBS могут быть добавлены другие соединения, например добавление EDTA к буферу полезно для промывания эритроцитов в тесте на перекрестную несовместимость.

ЭДТА предотвращает расщепление и лизирование фракции комплемента С1, присутствующей в сыворотке, в эритроциты, то есть позволяет избежать ложных результатов несовместимости. Кроме того, ЭДТА помогает диссоциировать клетки.

подготовка

Количество солей, которое необходимо взвесить для приготовления физиологического раствора с фосфатным буфером, будет зависеть от количества, которое необходимо приготовить:

-Фосфатно-солевой буферный раствор (10X PBS)

На один литр раствора:

Весить:

80,6 г NaCl,

2,2 г KCl,

11,5 г Na ₂ HPO ₄ ,

2,0 г KH ₂ HPO ₄

Техника подготовки

Поместите тяжелые соли в стакан, добавьте достаточное количество воды (80%) и перемешайте на перемешивающей пластине с помощью магнитной планки, пока соли не растворятся.

Приготовление PBS с использованием перемешивающей пластины с магнитным стержнем. Источник: Пользователь: Ruhrfisch, Википедия. ком

Фильтр для удаления нерастворенных частиц. Используйте фильтры с размером пор 0,45 мкм. Автоклав и асептическое распределение в колпаке с ламинарным потоком в стеклянных банках с крышками.

10-кратный раствор (концентрированный) не регулирует pH. Регулировку проводят после разбавления до концентрации буфера 1X PBS (разведение 1:10).

-Буферный фосфатный солевой раствор (1X PBS)

1X PBS можно приготовить непосредственно, взвесив соответствующее количество каждой соли, или его можно приготовить путем разбавления исходного раствора (1:10) стерильной дистиллированной водой.

-Чтобы приготовить один литр физиологического раствора с фосфатным буфером 1X PBS, взвесьте:

8,06 г NaCl,

0,22 г KCl,

1,15 г Na ₂ HPO ₄ ,

0,20 г KH ₂ HPO ₄

Техника подготовки

Действуйте, как описано в концентрированном растворе. Впоследствии необходимо отрегулировать pH. Для этого измерьте pH и, в зависимости от результата, используйте кислоту (HCl) или основание (NaOH), чтобы понизить или повысить pH, соответственно, до 7,4.

Кислота или основание добавляются по каплям, контролируя значение pH раствора с помощью pH-метра. Отфильтруйте, автоклавируйте и асептически распределите по коническим пробиркам или сосудам по мере необходимости.

-Чтобы приготовить 1X PBS из 10X исходного раствора:

Сделайте раствор 1:10. Например, чтобы приготовить 1 литр 1X PBS, отмерьте 100 мл исходного раствора и добавьте 700 мл стерильной дистиллированной воды. Отрегулируйте pH и залейте количество воды до 1000 мл.

Приготовленный буфер PBS бесцветный и прозрачный.

Ежедневный PBS можно хранить при комнатной температуре, а остальное в холодильнике.

Растворы для регулирования pH

HCl

На 100 мл 1 молярной HCl (соляной кислоты).

Отмерьте 91 мл дистиллированной воды и поместите его в стакан емкостью 250 мл.

Отмерьте 8,62 мл концентрированной HCl и медленно добавьте ее в стакан с водой (никогда не делайте наоборот). При работе с сильными кислотами (высококоррозионными веществами) примите соответствующие меры биобезопасности.

Перемешивайте в течение 5 минут, предпочтительно используя пластину для перемешивания с магнитной полосой внутри стакана. Перенести в колбу на 100 мл и долить до 100 мл дистиллированной H ₂ O.

NaOH,

На 100 мл NaOH (гидроксид натрия) 10 моляр.

Отмерьте 40 мл дистиллированной воды и поместите ее в стакан емкостью 250 мл. Отмерьте 40 г NaOH и добавьте в воду. Перемешайте, используя пластину для перемешивания с магнитной полосой внутри стакана.

Перелить в мерную колбу на 100 мл и долить до метки дистиллированной водой. Соблюдайте правила биобезопасности, поскольку эта реакция является экзотермической (она выделяет энергию в виде тепла).

Если вы хотите приготовить другое количество фосфатно-солевого раствора, вы можете обратиться к следующей таблице:

Источник: «Лаборатория вирусной геномики и геномики человека Медицинской школы UASLP»

Приложения

Он в основном используется в клеточной биологии, иммунологии, иммуногистохимии, бактериологии, вирусологии и исследовательских лабораториях.

Он идеально подходит для промывки клеток с помощью центрифуг (эритроцитов), промывок монослоев клеток, в методах спектроскопической эллипсометрии, для количественного определения бактериальных биопленок, для поддержания культур клеток на вирусы, в качестве промывочного раствора в методе непрямой иммунофлуоресценции. и в методах характеристики моноклональных антител.

Он также используется для транспортировки клеток или тканей, в качестве разбавителя для подсчета клеток, приготовления клеточных ферментов (трипсина), в качестве разбавителя для метода осушения биомолекул и для приготовления других реагентов.

С другой стороны, Мартин и др. В 2006 году продемонстрировали, что PBS можно использовать в лабораториях судебной экспертизы, в частности, для извлечения спермы из вагинальных мазков или вагинальных клеток из мазков полового члена. Таким образом можно установить, были ли сексуальные отношения.

Ограничения

-Некоторые буферы PBS содержат в качестве консерванта вещество, называемое азидом натрия. Это соединение может образовывать взрывчатые вещества при контакте со свинцом или медью. По этой причине следует соблюдать особую осторожность при сливе этого реагента в канализацию. Если его выбросить таким образом, необходимо обильно добавить воду, чтобы максимально разбавить его.

-Цинк не следует добавлять в фосфатный буфер, так как он вызывает выпадение в осадок некоторых солей.

-Wangen et al. В 2018 году определили, что использование PBS не подходит для отмывки первичных клеток острого миелоидного лейкоза (AML), извлеченных из периферической крови, из-за того, что многие клетки теряются в результате лизиса с большим уменьшением количества материала белка.

Поэтому они определили, что первичные клетки AML не следует мыть PBS после хранения в жидком азоте.

Ссылки

1. Колл Дж. (1993). Диагностические методы в вирусологии. Эд Диас де Сантос. 360 пг
2. Родригес М., Ортис Т. Культура клеток. Смена среды. Кафедра нормальной и патологической цитологии и гистологии Севильского университета. Доступно на personal.us.es
3. Приготовление физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS). (2008). Стандартные операционные процедуры (СОП) Лаборатория геномики человека и вирусов Медицинский факультет UASLP. Доступно на: genomica.uaslp.mx
4. «Фосфатный буферный раствор». Википедия, свободная энциклопедия. 3 апреля 2019, 19:36 UTC. 13 апр 2019, 02:57 en.wikipedia.org.
5. Пьетрасанта Л., Фон-Бильдерлинг К. Вопросы молекулярной биофизики. Доступно на: users.df.uba.ar
6. Rediar. Руководство. PBS + EDTA. Доступно на: felsan.com.ar
7. Мартин NC, Пири А.А., Форд Л.В., Каллаган С.Л., МакТерк К., Люси Д., Скримгер Д.Г. Использование физиологического раствора с фосфатным буфером для извлечения клеток и сперматозоидов из мазков. Sci Justice. 2006; 46 (3): 179-84. Доступно на: ncbi.nlm.nih.gov
8. Ванген Р., Осебо Э., Трентани А. и др. Метод консервации и промывание солевым раствором с фосфатным буфером влияют на протеом острого миелоидного лейкоза. Int J Mol Sci. 2018; 19 (1): 296. Доступно на: ncbi.nlm.nih.gov
9. Мартинес Р., Грагера Р. (2008). Теоретические и практические основы гистохимии. Высший совет научных исследований. Мадрид. Доступно на: books.google.co.ve