ОКРАШИВАНИЕ ПО ЦИЛЮ-НИЛЬСЕНУ: ОБОСНОВАНИЕ, РЕАКТИВЫ И МЕТОДИКА - БИОЛОГИЯ - 2024

Цилю-Нильсену окрашивающий метод для идентификации микроорганизмов , устойчивый алкоголь кислоты (ARA). Название этой микробиологической процедуры относится к ее авторам: бактериологу Францу Цилю и патологу Фридриху Нильсену.

Этот метод представляет собой тип дифференциального окрашивания, который подразумевает использование разных красителей для создания контраста между структурами, которые вы хотите наблюдать, различать и позже идентифицировать. Краситель Циля-Нильсена используется для идентификации определенных типов микроорганизмов.

Пятно Циля-Нильсена

Некоторыми из этих организмов являются микобактерии (например, Mycobacterium tuberculosis), нокардии (например, Nocardia sp.) И некоторые одноклеточные паразиты (например, Cryptosporidium parvum). Многие бактерии можно классифицировать с помощью обычного метода, называемого окрашиванием по Граму.

Однако некоторые группы бактерий требуют других методов для их идентификации. Такие методы, как окрашивание по Цилю-Нильсену, требуют сочетания красителей с нагреванием для закрепления красителей на стенке клетки.

Затем следует процесс отбеливания, который дает два результата: устойчивость или чувствительность к изменению цвета под действием кислот и спиртов.

основа

Обоснование этого метода окрашивания основано на свойствах клеточной стенки этих микроорганизмов. Стена состоит из типа жирных кислот, называемых миколиновыми кислотами; Для них характерны очень длинные цепи.

Когда жирные кислоты имеют очень длинную структуру, они легче удерживают красители. Некоторые виды бактерий очень трудно окрашивать по Граму из-за высокого содержания миколиновых кислот в клеточной стенке.

Краситель Циля-Нильсена использует фенольное соединение карбол фуксин, основное краситель. Он обладает способностью взаимодействовать с жирными кислотами клеточной стенки, которая имеет восковую текстуру при комнатной температуре.

Окрашивание карбол-фуксином усиливается в присутствии тепла, так как воск плавится и молекулы красителя быстрее перемещаются в клеточную стенку.

Кислота, которая используется позже, служит для обесцвечивания клеток, которые не были окрашены, потому что их стенка не была в достаточной степени связана с красителем; следовательно, кислотный отбеливатель способен удалить кислотный краситель. Клетки, устойчивые к такому обесцвечиванию, называются кислотостойкими.

Вторичный краситель

После обесцвечивания образца его контрастируют с другим красителем, называемым вторичным красителем. Обычно используется метиленовый синий или малахитовый зеленый.

Вторичный краситель окрашивает фоновый материал и, следовательно, создает контраст по сравнению с структурами, окрашенными на первом этапе. Только обесцвеченные клетки поглощают второй краситель (контрастное окрашивание) и приобретают свой цвет, в то время как кислотоустойчивые клетки сохраняют свой красный цвет.

Эта процедура часто используется для идентификации Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium leprae, которые называются кислотоустойчивыми бациллами.

Реагенты

Первичный краситель

Используется 0,3% карбол фуксина (фильтрованный). Этот краситель готовят из смеси спиртов: фенола в этаноле (90%) или метаноле (95%), и в этой смеси растворяют 3 грамма основного фуксина.

Отбеливающий раствор

На этом этапе можно использовать растворы 3% спиртовой кислоты или 25% серной кислоты.

Вторичный краситель (контр-краситель)

Краситель, наиболее используемый для контрастирования образцов, обычно 0,3% метиленового синего. Однако можно использовать и другие, например 0,5% малахитового зеленого.

Техника

Кислотно-быстрая процедура окрашивания

Подготовьте бактериальный мазок

Эта подготовка выполняется на чистом сухом предметном стекле с соблюдением мер предосторожности.

Сушка мазка

Дайте мазку высохнуть при комнатной температуре.

Нагрейте образец

Образец следует нагреть, приложив огонь к слайду ниже. Спиртовую фиксацию можно провести, если мазок не был приготовлен с мокротой (обработан гипохлоритом натрия для его отбеливания) и если мазок не собирается сразу окрашивать.

M. tuberculosis удаляют с помощью отбеливателя и в процессе окрашивания. Тепловая фиксация необработанной мокроты не убивает M. tuberculosis, в то время как фиксация алкоголем является бактерицидной.

Закройте пятно

Пятно покрывают раствором карбол-фуксина (первичное основное пятно).

Нагрейте пятно

Делается это за 5 минут. Вы должны заметить выделение пара (примерно 60 ° C). Важно не перегревать и не поджечь образец.

Что касается нагревания пятна, следует проявлять особую осторожность при нагревании карбол-фуксина, особенно если окрашивание проводится на поддоне или другом контейнере, в котором были собраны легковоспламеняющиеся химикаты от предыдущего окрашивания.

Под предметные стекла следует подавать лишь небольшое пламя, используя предварительно зажженный тампон, смоченный несколькими каплями кислого спирта, метанола или 70% этанола. Не используйте большой тампон, смоченный в этаноле, так как это может привести к пожару.

Вымойте пятно

Эта промывка должна выполняться чистой водой. Если водопроводная вода не чистая, промойте мазок фильтрованной или дистиллированной водой, желательно.

Покройте мазок кислотным спиртом.

Этот кислый спирт должен быть 3%. Покрытие проводят в течение 5 минут или до тех пор, пока мазок не станет достаточно обесцвеченным, т.е. станет бледно-розовым.

Необходимо учитывать, что кислый спирт легко воспламеняется; поэтому его следует использовать с большой осторожностью. Избегайте нахождения вблизи источников возгорания.

Вымойте пятно

Мытье следует чистой дистиллированной водой.

Покройте мазок морилкой

Это может быть малахитовое зеленое (0,5%) или метиленовое синее (0,3%) пятно на 1–2 минуты, если мазок тонкий.

Вымойте пятно

Снова следует использовать чистую (дистиллированную) воду.

Осушать

Обратную сторону предметного стекла следует очистить, а пятно поместить на дренажную решетку, чтобы дать ему высохнуть на воздухе (не используйте промокательную бумагу для сушки).

Изучите мазок под микроскопом.

Необходимо использовать объектив 100X и иммерсионное масло. Систематически сканируйте мазок и записывайте соответствующие наблюдения.

Интерпретируйте результаты

Теоретически микроорганизмы, окрашивающие красноватый цвет, считаются кислотоустойчивыми положительными (AAR +).

Напротив, если микроорганизмы окрашиваются в синий или зеленый цвет, в зависимости от красителя, используемого в качестве контр-красителя, они считаются кислотоустойчивыми отрицательными (AAR-).

Ссылки

1. Апурба, С. & Сандхья, Б. (2016). Основы практической микробиологии (1-е изд.). Издательство Jaypee Brothers Medical.
2. Бауман, Р. (2014). Микробиология с заболеваниями по системам организма (4-е изд.). Pearson Education, Inc.
3. Наследие, Дж., Эванс, Э. и Киллингтон, А. (1996). Вводная микробиология (1-е изд.). Издательство Кембриджского университета.
4. Морелло, Дж., Гранато, П. Уилсон, М. и Мортон, В. (2006). Лабораторное руководство и рабочая тетрадь по микробиологии: приложения для ухода за пациентами (11-е изд.). McGraw-Hill Education.
5. Васантакумари, Р. (2007). Учебник микробиологии (1-е изд.). BI Publications PVT.