СРЕДА ЛЕВЕНШТЕЙНА-ЙЕНСЕНА: ОСНОВА, ПОДГОТОВКА И ПРИМЕНЕНИЕ - БИОЛОГИЯ - 2025

Среда Левенштейна-Йенсена является селективной твердой средой для выделения и развития бактерий рода Mycobacterium, таких как Mycobacterium tuberculosis, M. avium, среди других, за исключением видов лепры, которые не культивируются.

Бактерии рода Mycobacterium не растут в обычных питательных средах, поэтому для их выделения необходимо было разработать специальную среду. Исходный носитель был создан Левенштейном, а затем модифицирован Йенсеном.

Среда Левенштейна-Йенсена с колониями Mycobacterium tuberculosis. Источник: Агарвал и др. / BioMed Central Ltd., любезно предоставлено Библиотекой изображений биологии.

Модификация заключалась в удалении красителя Конго красный и замене его более высокой концентрацией малахитового зеленого. Он также изменил концентрацию цитрата магния и монокалиевого фосфата.

В настоящее время среда Левенштейна-Йенсена содержит картофельный крахмал, аспарагин, цитрат магния, монокалиевый фосфат, сульфат магния, малахитовый зеленый, налидиксовую кислоту, циклогексимид, линкомицин, взбитые яйца, глицерин и воду.

Микобактерии обычно выделяются из нестерильных участков, таких как мокрота, моча, абсцессы и другие. Это означает, что большинство образцов будет содержать обычную микробиоту местности, а также патоген.

Вот почему среда Левенштейна-Йенсена содержит в своем составе ряд ингибиторов, представленных малахитовым зеленым, антибиотиками и противогрибковыми средствами.

Кроме того, образцы, поступающие из нестерильных участков, должны быть обеззаражены и нейтрализованы перед посевом в среду Левенштейна-Йенсена.

основа

Присутствие яиц и глицерина в среде Левенштейна-Йенсена стимулирует рост микобактерий, поскольку они обеспечивают жирные кислоты и белки, необходимые для развития этих микроорганизмов.

Среда Левенштейна-Йенсена содержит малахитовый зеленый, который является ингибитором сопутствующей микробиоты. Но он также содержит налидиксовую кислоту (35 мкг / мл), подавляющую грамотрицательную микробиоту, циклогексимид (400 мкг / мл), подавляющий сапрофитные грибы и дрожжи, и линкомицин (2 мкг / мл), подавляющий грамположительную микробиоту.

Некоторые коммерческие компании предпочитают добавлять следующую комбинацию антибиотиков: полимиксин B 200000 единиц / л, амфотерицин B 10 мг / л, карбенициллин 50 мг / л и триметоприм 10 мг / л.

Эта среда не содержит агара, поэтому затвердевание среды происходит за счет коагуляции альбумина, присутствующего в яйце во время стерилизации.

подготовка

Взвешивают 37,3 г дегидратированной среды в 600 мл дистиллированной воды, к которой предварительно было добавлено 12 мл глицерина. Смесь нагревают, часто помешивая, до полного растворения. Автоклавировать среду при 121 ° C в течение 15 минут.

С другой стороны, однородную суспензию из 1000 мл свежих яиц следует готовить в асептических условиях. Добавьте яичную суспензию в 600 мл среды, приготовленной при температуре 50–60 ° C, избегая образования пузырьков воздуха.

Растворы антибиотиков также добавляются после стерилизации в автоклаве.

Разлейте среду в стерильные пробирки с завинчивающейся крышкой. Нагрейте пробирки при 85 ° C в течение 45 минут в наклонном положении.

Цвет приготовленной среды - аквамариново-зеленый, на нем могут появиться беловатые пятна из-за наличия липидов яйца.

PH среды должен составлять 7,2 ± 0,2.

Храните пробирки в холодильнике в защищенном от прямого света месте до использования. Перед посевом закалять.

Существует модификация медиума, названная «Модификация Gruft для Löwenstein Jensen». Он содержит те же соединения, что и классическая среда, но с добавлением РНК-5 мг / 100 мл, а в качестве ингибиторов он содержит 0,025 г / 100 мл малахитового зеленого, 50 Ед / мл пенициллина и 35 мкг / мл налидиксовой кислоты.

Приложения

Среда Левенштейна-Йенсена используется для выделения микобактерий из различных типов образцов. Окрашивание по Цилю-Нильсену рекомендуется для любого образца, в котором есть подозрение на присутствие микобактерий.

Некоторые образцы поступают из стерильных мест, а другие - нет. Нестерильные образцы необходимо дезактивировать соответствующим образом:

мокрота

Обеззараживание образцов мокроты следует проводить следующим образом: определить количество образца мокроты в мл и добавить такое же количество 4% NaOH к образцу и инкубировать при 37 ° C.

Часто встряхивайте смесь в течение 30 минут. Затем центрифугируйте при 3000 об / мин в течение 30 минут.

Удалите супернатант над фенольным дезинфицирующим раствором. Используйте осадок для посева, но предварительно необходимо нейтрализовать pH.

Чтобы нейтрализовать осадок, используется 5% H ₂ SO ₄ в присутствии индикатора фенолового красного до тех пор, пока он не достигнет нейтрального значения pH, вызывающего окраску лосося.

Промывание желудка, бронхов и бронхиальный аспират

В этом случае образец необходимо центрифугировать при 3000 об / мин в течение 30 минут. Супернатант отбрасывают и используют осадок. Чтобы обеззаразить осадок, добавьте 3 мл 4% NaOH и часто перемешивайте при 37 ° C в течение получаса.

Снова центрифугируйте, супернатант удаляют и осадок используют. Последние должны быть нейтрализованы, как указано в образце мокроты.

урина

Дайте образцу отстояться в холодильнике на 24 часа. Отделите супернатант. Оставшийся осадок следует центрифугировать в течение 30 минут при 3000 об / мин. Снова слейте супернатант и восстановите осадок 3 мл стерильного физиологического раствора.

Добавьте 3 мл 4% NaOH и приступите к обеззараживанию и нейтрализации, как описано ранее.

Асцитная жидкость, плевральная жидкость, спинномозговая жидкость

В этом типе образца его центрифугируют, а супернатант отбрасывают. Выполните анализ осадка по Граму или наблюдайте прямо под микроскопом; Если бактерии не наблюдаются, этап обеззараживания не требуется, как и этап нейтрализации.

В этом случае проба может быть засеяна непосредственно из осадка. Если есть бактерии, приступите к обеззараживанию и нейтрализации, как описано выше.

Биопсия

К этому типу образца необходимо добавить 5 мл дистиллированной воды и затем центрифугировать при 1500 об / мин в течение 10 минут. Удалите супернатант и повторно центрифугируйте осадок при 3500 об / мин в течение 30 минут. Используйте осадок для посева питательной среды.

Мазок из гортани

Тампон следует поместить в стерильную пробирку, содержащую в равных частях дистиллированную воду и 4% NaOH. Тампон необходимо прижать к стенкам пробирки, чтобы проба растворилась в жидкости. Центрифугируйте и используйте осадок. Нейтрализуйте осадок, как уже описано.

Посевная

Среду Левенштейна-Йенсена засевают, добавляя 0,5 мл образца на поверхность среды. Поверните пробирку, чтобы распределить образец по среде. Не используйте платиновую ручку.

Во вторую пробирку со средой Стоунбринка можно засеять, чтобы изолировать Mycobacterium bovis и другие виды, которые не растут на среде Левенштейна-Йенсена.

инкубация

Засеянные пробирки инкубируют в аэробных условиях при 37 ° C, при этом крышка слегка ослаблена, наклонена примерно на 5 ° и защищена от света. Окружающая среда может быть обогащена углекислым газом на 5–10%. Проверяйте культуры дважды в неделю, пока не появятся колонии.

Когда образец впитается, колпачки закрывают. Максимальное время инкубации составляет 8 недель, если по истечении этого времени рост отсутствует, это считается отрицательным.

контроль качества

Следующие штаммы могут использоваться в качестве контроля качества:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922cus, Cryofococcus pyogenes ATpCC 19615 32015, Streptococcus pyogenes ATpCC 19615 32015, Streptococcus pyogenes ATpCC 19615 из 32015

Ожидается отличное развитие первых трех упомянутых видов, для M. fortuitum рост должен быть хорошим, а для M. bovis ожидается небольшой рост или его отсутствие. Между тем, необходимо полностью подавить другие виды, кроме рода Mycobacterium.

Ограничения

Подготовленную среду необходимо защищать от света, длительное воздействие света приводит к тому, что среда меняет цвет с зеленого на синий, в этом случае среду использовать нельзя. Это потому, что малахитовый зеленый светочувствителен.

Среда, содержащая яйца, может быть легко загрязнена, если с ней не обращаться в асептических условиях. Его можно растворить, если он будет заражен протеолитическими бактериями.

Для выращивания бактерий рода Mycobacterium и манипуляций с ними требуется квалифицированный персонал, который осведомлен о мерах биобезопасности, которые необходимо соблюдать, чтобы избежать заражения или заражения других.

HCl не следует использовать на стадии нейтрализации из-за образования хлорида натрия, который может быть токсичным для бациллы Коха.

Образцы следует хранить в холодильнике и защищать от света, пока они не обрабатываются.

Ссылка

1. Лаборатории Франсиско Сориа Мельгисо. 2009. Селективная среда Левенштейна-Йенсена. Доступно на: f-soria.es
2. Britannia Laboratories. 2017. Среда Левенштейна-Йенсена. Доступно на: britanialab.com.
3. Neogen Laboratories. Среда Левенштейна-Йенсена. Доступно на: foodsafety.neogen.com.
4. «Среда Левенштейна-Йенсена». Википедия, свободная энциклопедия. 20 ноя 2018, 15:15 UTC. 24 апр 2019, 18:34. wikipedia.org
5. Конеман Э, Аллен С., Джанда В., Шрекенбергер П., Винн В. (2004). Микробиологическая диагностика. 5-е изд. Редакция Panamericana SA Аргентина.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Микробиологический диагноз Бейли и Скотта. 12 изд. Редакция Panamericana SA Аргентина.
7. Мак Фаддин Дж. (2003). Биохимические тесты для идентификации бактерий, имеющих клиническое значение. 3-е изд. Редакция Panamericana. Буэнос айрес. Аргентина.