ОКРАШИВАНИЕ ПО ГРАМУ: ОБОСНОВАНИЕ, МАТЕРИАЛЫ, ТЕХНИКА И ПРИМЕНЕНИЕ - БИОЛОГИЯ - 2024

Граму является самым простым и наиболее полезным Окрашивание методом в диагностической микробиологии. Этот метод был создан датским врачом Гансом Христианом Грамом в 1884 году, которому удалось классифицировать бактерии как грамположительные и грамотрицательные в соответствии с составом клеточной стенки.

В 1921 году Хакер внес в этот метод определенные модификации для стабилизации реагентов и улучшения качества окрашивания, поэтому окраска по Граму также известна как окраска по Граму-Хакеру.

Различные мазки окрашены по Граму. A. Грамположительные кокки. Б. Грамотрицательные стержни. C. Грамположительные, полиморфноядерные и мононуклеарные бациллы. D. Дрожжи.

С помощью этого метода также можно наблюдать форму микроорганизмов, то есть, являются ли они, среди прочего, кокками, бациллами, коккобациллами, плеоморфными, нитевидными. А также его распределение в пространстве: кластером, цепочкой, изолированно, парами, тетрадами и т. Д.

При подозрении на бактериальную инфекцию большинство полученных образцов следует размазать на предметном стекле и окрасить по Граму для исследования под микроскопом.

Отчет по Граму поможет врачу определить тип микроорганизма, который может быть причиной инфекции, до получения окончательного результата посева.

В некоторых случаях жизнь пациента очень скомпрометирована, поэтому врачам срочно требуется отчет по Граму, чтобы назначить эмпирическое лечение, пока они ждут идентификации микроорганизма.

Например, если Грамм показывает, что в спинномозговой жидкости есть грамположительные кокки, врач назначит начальную терапию антибиотиками, устраняющими этот тип бактерий, в соответствии с протоколами, установленными для этого.

Как только будет получен окончательный результат с названием изолированного микроорганизма и соответствующей антибиотикограммой, врач оценит, следует ли менять терапию. Это решение будет принято на основании изучения чувствительности микроорганизма к принимаемым им антибиотикам и эволюции пациента.

основа

Это метод, который состоит из 4 основных этапов: окрашивания, фиксации протравой, обесцвечивания и контрастирования. Следовательно, этот метод, помимо окрашивания бактерий, также позволяет их дифференцировать.

Кристаллический фиолетовый - первый использованный краситель. Он имеет сродство к пептидогликану и окрашивает все присутствующие бактерии в фиолетовый цвет, затем помещается люголь, который действует как протрава, то есть он будет индуцировать образование нерастворимых кристаллических комплексов фиолетового иода - рибонуклеарных белков внутри клетки. .

Грамположительные бактерии, имеющие толстую стенку пептидогликана, образуют больше комплексов (кристаллический фиолетовый-йод), поэтому они сохраняют краситель.

Кроме того, это также влияет на то, что стенка грамположительных бактерий содержит большее количество ненасыщенных кислот, которые проявляют большое сродство с окислителями (Люголь).

Между тем, грамотрицательные бактерии имеют тонкий слой пептидогликана, из-за чего бактерии образуют меньше комплексов, чем грамположительные.

Затем следует этап обесцвечивания, на котором грамположительные и грамотрицательные бактерии ведут себя по-разному.

Грамотрицательные бактерии содержат внешнюю мембрану, богатую липополисахаридами, которая является частью их клеточной стенки. Жиры разрушаются при контакте с ацетоновым спиртом, поэтому внешняя мембрана дестабилизируется, высвобождая фиолетовый кристалл.

Вот как сафранин или основной фуксин противодействуют этому, и он становится красным.

В случае грамположительных бактерий они сопротивляются выцветанию, потому что отбеливатель закрывает поры, предотвращая вытекание комплекса кристаллический фиолетовый / йод.

Следовательно, окраска кристаллическим фиолетовым остается стабильной, и здесь нет места для сафранина или фуксина. Вот почему эти бактерии окрашиваются в темно-синий или фиолетовый цвет.

материалы

Набор для окрашивания по Граму состоит из:

• Фиолетовое стекло
• Люголь
• Ацетоновый спирт
• Сафранин или основной фуксин

Приготовление красителей и реагентов

Кристаллический фиолетовый раствор

Решение для:

Фиолетовый кристалл ------------- 2 гр

Этиловый спирт 95% ----------- 20cc

Решение B:

Оксалат аммония ----------- 0,8 г

Дистиллированная вода ------------- 80 куб.

Для окончательного приготовления кристаллического фиолетового раствор А необходимо разбавить 1:10 дистиллированной водой и смешать с 4 частями раствора Б. Перед использованием смесь выдерживают 24 часа. Отфильтруйте в бутылку для окрашивания янтарного цвета, используя фильтровальную бумагу.

Ежедневное количество переносится в янтарную бутылку-капельницу.

Йодо-Люголь

Взвесьте и отмерьте указанное количество каждого соединения следующим образом:

Кристаллы йода ------------- 1гр

Иодид калия ------------- 2гр

Дистиллированная вода ------------- 300 куб.

Йодид калия постепенно растворяется в воде, а затем добавляется йод. Раствор врезается в янтарную бутылку.

Ежедневное количество переносится в меньшую желтую бутылку с помощью пипетки.

Отбеливание

95% этиловый спирт -----------– 50 мл

Ацетон ------------------ 50 мл

Готовится в равных частях. Хорошо накройте, так как он имеет свойство испаряться.

Поместите во флакон-капельницу.

Этот препарат обеспечивает обесцвечивание за умеренное время 5-10 секунд и является наиболее рекомендуемым.

Новички предпочитают использовать только 95% этиловый спирт, при котором выцветание происходит медленнее 10–30 секунд.

А более опытные могут использовать чистый ацетон, где обесцвечивание происходит очень быстро от 1 до 5 сек.

Контраст

Стандартный раствор сафранина

Сафранина -------------– 2,5 гр

Этиловый спирт 95% --------– 100 см3

После взвешивания указанного количества сафранина его растворяют в 100 мл 95% этилового спирта.

Рабочий раствор сафранина готовят из основного раствора.

Для этого отмерьте 10 см3 основного раствора, добавьте 90 см3 дистиллированной воды, чтобы получить 100 мл.

Ежедневное количество рекомендуется перелить в янтарный флакон с пипеткой.

Микроорганизмы, слабо окрашивающие грамотрицательную окраску по Граму-Хакеру, такие как некоторые анаэробы, Legionella sp, Campylobacter sp и Brucella sp, могут быть окрашены намного лучше, используя модификацию окраски по Граму-Хакеру Копелоффа. называется пятном Грама-Копелова.

Этот метод заменяет краситель сафранин на основной фуксин. Эта модификация позволяет эффективно окрашивать вышеупомянутые микроорганизмы.

Хранение реагентов

Готовые красители следует хранить при комнатной температуре.

Подготовка мазка окрашиваемого образца

Образец должен содержать не менее 10 ⁵ микроорганизмов, прежде чем можно будет обнаружить микроорганизм в мазке. Мазки можно делать из прямого образца или из культур в твердой или жидкой среде.

Мазки должны быть однородными, хорошо распределенными и не слишком толстыми для лучшей визуализации имеющихся структур.

-Грамма прямых проб

Грамм нецентрифугированной мочи

Мочу перемешивают и на предметное стекло помещают 10 мкл. Наблюдение хотя бы одной бактерии / поля Dip указывает на наличие инфекции.

Это означает, что в 85% случаев культура будет иметь примерно более 100 000 КОЕ / мл (10 ⁵ КОЕ / мл) мочи.

Этот метод не подходит для количества колоний ниже 100 000 КОЕ.

CSF грамм

ЦСЖ следует центрифугировать, супернатант удалить, а осадок распределить по предметному стеклу. Эта жидкость стерильна при нормальных условиях; наблюдение за бактериями указывает на инфекцию.

Грамм респираторных образцов

Грамм мокроты, бронхиальный или бронхоальвеолярный лаваж, хотя могут быть различные микроорганизмы, всегда будут определять диагноз, в дополнение к полезному типу наблюдаемых клеток.

В случае мокроты мазок следует готовить с наиболее гнойных участков образца.

Грамм стула

Не рекомендуется выполнять грамм для этого типа образцов, поскольку он не имеет диагностической ценности.

-Грамм урожая

Их можно сделать двумя способами: одним из жидких культур, а другим - из твердых культур.

Жидкие культуры

Из жидких культур это предельно просто; Несколько порций мутного бульона берут под горелку и помещают на чистую и сухую горку, делая круговые движения от центра к периферии, чтобы равномерно распределить материал.

Дайте ему высохнуть на воздухе. После высыхания материал прикрепляется к листу с помощью тепла. Для этого с помощью пинцета лист пропускают 3–4 раза через пламя горелки Бунзена, стараясь не поджечь материал.

Листу дают остыть и кладут на красящий мостик.

Твердые культуры

Чтобы выполнить мазок на окрашивание по Граму из твердой культуры, выполните следующие действия:

Перед выбором колоний для взятия необходимо подготовить предметное стекло, поместив примерно две капли стерильного физиологического раствора.

Если исходная пластина для культивирования содержит несколько различных типов колоний, для проведения анализа по Граму будет выбрана отдельная колония из каждой. Каждую колонию отбирают с помощью платиновой петли для растворения в физиологическом растворе, предварительно помещенном на предметное стекло.

Круговые движения производятся от центра к периферии для равномерного распределения колонии на предметном стекле.

Дайте ему высохнуть на воздухе. После высыхания лист фиксируется теплом, как объяснялось ранее (обжигая предметное стекло зажигалкой), стараясь не поджечь материал.

Эту процедуру необходимо проделывать с каждым типом колонии. На листе бумаги следует отметить порядок наблюдаемого, например:

Колония 1: бета-гемолитическая желтая колония: грамположительные кокки наблюдались группами

Колония 2: колония кремового цвета, без гемолиза: наблюдались грамотрицательные коккобациллы.

Каждый слайд должен быть помечен, чтобы знать, что мы наблюдаем.

Техника

Техника окрашивания по Граму чрезвычайно проста в исполнении и относительно недорога, и ее нельзя пропустить в микробиологической лаборатории.

Это делается следующим образом:

1. Закрепите мазок теплом и поместите на мостик для окрашивания.
2. Полностью покройте предметное стекло кристально-фиолетовым на 1 минуту.
3. Смыть водой Не сушить
4. Залить лист раствором люголя, оставить на 1 минуту. Смыть водой Не сушить.
5. Отбеливать в течение 5-10 секунд легким встряхиванием в спирте и ацетоне. Или поместите лист в вертикальное положение и капайте обесцвечивающее средство на поверхность до тех пор, пока не будут удалены излишки неудержавшегося фиолетового стекла. Не превышать.
6. Смыть водой Не сушить.
7. Замените предметное стекло на окрашивающем мостике и накройте на 30 секунд сафранином (по Граму-Хакеру) или на 1 минуту основным фуксином (по Граму-Копелефф).
8. Промыть водой
9. Дайте ему высохнуть на воздухе в вертикальном положении.

После высыхания поместите 1 каплю иммерсионного масла, чтобы наблюдать ее под объективом 100X в световом микроскопе.

Утилита

Этот метод позволяет различать морфотинториальные различия большинства бактерий.

Этой окраской также отличаются дрожжи. Берут кристаллический фиолетовый, то есть окрашивают грамположительными.

С другой стороны, можно выделить спорообразующие грамположительные бациллы, у которых внутри бациллы наблюдается чистое пространство, где формируются эндоспоры, хотя споры плохо окрашиваются. Для окрашивания спор используются другие методы, такие как Шеффер-Фултон.

Следует отметить, что это окрашивание применяется не для окраски всех видов бактерий, то есть есть случаи, в которых окрашивание не работает.

В этом случае можно упомянуть бактерии, лишенные клеточной стенки. Например: род Mycoplasma, сферопласты, уреаплазмы, L-формы и протопласты.

Он также очень плохо окрашивает бактерии, стенки которых богаты миколиновыми кислотами, такие как микобактерии, и внутриклеточные бактерии, такие как хламидии и риккетсии.

Он также неэффективен для окрашивания большинства спирохетальных бактерий.

Есть бактерии того же рода, которые можно наблюдать в одном образце как грамположительные, так и грамотрицательные. Когда это происходит, это называется переменным окрашиванием по Граму, которое может быть связано с изменением питательных веществ, температуры, pH или концентрации электролита.

Распространенные ошибки

Преувеличенное отбеливание

Преувеличение стадии обесцвечивания может привести к обнаружению ложных грамотрицательных микроорганизмов.

Не дожидаясь достаточного времени высыхания, чтобы добавить иммерсионное масло

Это может вызвать окрашивание грамположительных бактерий на грамотрицательные (ложные грамотрицательные). Это происходит потому, что в старых культурах могут быть мертвые или испорченные бактерии, и в этих условиях бактерии не сохраняют кристаллический фиолетовый цвет.

Используйте очень старый раствор люголя:

Со временем люголь теряет свои свойства и его цвет тускнеет. Если используется уже дегенерированный реагент, он не будет хорошо фиксировать кристаллический фиолетовый, поэтому существует возможность получения визуализации ложно грамотрицательных микроорганизмов.

Синий фон

Правильно обесцвеченный фон будет красным. Синий фон означает, что обесцвечивание было недостаточным.

Ссылки

1. Райан К.Дж., Рэй С. 2010. Шеррис. Медицинская микробиология, 6-е издание, МакГроу-Хилл, Нью-Йорк, США
2. Конеман Э, Аллен С., Джанда В., Шрекенбергер П., Винн В. (2004). Микробиологическая диагностика. (5-е изд.). Аргентина, редакция Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Микробиологическая диагностика Бейли и Скотта. 12 изд. Аргентина. Редакция Panamericana SA
4. Касас-Ринкон Г. 1994. Общая микология. 2-е изд. Центрального университета Венесуэлы, Библиотечные издания. Венесуэла Каракас.
5. "Окраска по Граму." Википедия, свободная энциклопедия. 4 октября 2018 г., 23:40 UTC. 9 декабря 2018, 17:11. Взято с es.wikipedia.org.
6. Гонсалес М., Гонсалес Н. 2011. Руководство по медицинской микробиологии. 2-е издание, Венесуэла: Управление СМИ и публикаций Университета Карабобо.
7. Лопес-Хакоме Л., Эрнандес-Дуран М., Колин-Кастро С., Ортега-Пенья С., Серон-Гонсалес Г., Франко-Сендехас Ф. Основные красители в микробиологической лаборатории. Исследования в области инвалидности. 2014; 3 (1): 10-18.