ПЯТНО ГИМЗЫ: ОБОСНОВАНИЕ, МАТЕРИАЛЫ, ТЕХНИКА И ПРИМЕНЕНИЕ - БИОЛОГИЯ - 2025

Краситель Гимза представляет собой тип окраски клинических образцов, на основе смеси кислот и основных красителей. Его создание было вдохновлено работой Романовского, где Густав Гимза, химик и бактериолог родом из Германии, усовершенствовал его, добавив глицерин для стабилизации соединений.

Изменения, внесенные в исходную технику Романовского, позволили значительно улучшить микроскопические наблюдения, поэтому метод получил название окраски Гимзы.

Различные образцы окрашены красителем Гимза. A. Trypanosoma evansi в периферической крови. Б. Нормальные клетки крови. C. Borrelia theileri в периферической крови. Лимфома Д. Беркитта.

Поскольку это простой в исполнении, высокофункциональный и экономичный метод, в настоящее время он широко используется в клинических лабораториях для получения гематологических мазков, образцов костного мозга и срезов тканей.

Метод окрашивания по Гимзе очень полезен для цитологических исследований, поскольку он позволяет наблюдать специфические клеточные структуры. Этот метод окрашивает цитоплазму, ядра, ядрышки, вакуоли и гранулы клеток, позволяя различать даже тонкие следы хроматина.

Кроме того, могут быть обнаружены значительные изменения размера, формы или окраски ядра, что позволяет визуализировать потерю взаимосвязи ядро-цитоплазма.

С другой стороны, он позволяет идентифицировать незрелые клетки в костном мозге и периферической крови, что важно для диагностики серьезных заболеваний, таких как лейкемия. Также возможно обнаружение гемопаразитов, внеклеточных и внутриклеточных бактерий, грибов и других.

В цитогенетике он широко используется, поскольку позволяет изучать митоз клеток.

Основа окрашивания по Гимзе

Красители типа Романовского основаны на использовании контраста между кислотными и основными красителями для достижения окрашивания основных и кислотных структур соответственно. Как можно видеть, кислотные красители обладают сродством к окрашиванию основных структур и наоборот.

Используемый основной краситель - это метиленовый синий и его окисленные производные (Azure A и Azure B), а кислотный краситель - это эозин.

Кислотные структуры клеток - это нуклеиновые кислоты, гранулы сегментированных базофилов, среди прочего, поэтому они будут окрашены метиленовым синим.

В этом же смысле основными структурами клеток являются гемоглобин и некоторые гранулы, например, содержащиеся в сегментированных эозинофилах; они будут окрашены эозином.

С другой стороны, из-за того, что метиленовый синий и лазурный характеризуются как метахроматические красители, они могут придавать различный оттенок различным структурам в зависимости от содержания полианионов, которыми они обладают.

Вот как стратегическая комбинация основных и кислотных красителей позволяет развить широкий спектр цветов в соответствии с биохимическими характеристиками каждой структуры, переходя через бледно-синие, темно-синие, сиреневые и фиолетовые оттенки в случае кислотных структур.

В то время как окраска, обеспечиваемая эозином, более стабильна, создавая цвета от красновато-оранжевого до лососевого.

материалы

Материалы для приготовления маточного раствора

Для приготовления основного раствора необходимо взвесить 600 мг порошкообразного красителя Гимза, отмерить 500 см3 метилового спирта без ацетона и 50 см3 нейтрального глицерина.

Как приготовить основной раствор

Поместите тяжелый порошок Гимзы в ступку. Если есть комочки, их следует опрыскать. Затем добавьте заметное количество отмеренного глицерина и хорошо перемешайте. Полученную смесь переливают в очень чистую янтарную бутылку.

Остальной глицерин помещаем в ступку. Снова перемешайте, чтобы очистить остатки красителя, приставшего к стенкам раствора, и перелейте в ту же банку.

Бутылку закрывают крышкой и помещают на водяную баню при 55ºC на 2 часа. Пока он находится на водяной бане, осторожно встряхивайте смесь каждые полчаса или около того.

Впоследствии смеси дают остыть для размещения спирта. Предварительно часть отмеренного спирта помещается в ступку, чтобы завершить промывку оставшегося красителя, а затем добавляется в смесь вместе с остальным спиртом.

Этому препарату следует дать созреть не менее 2 недель. Использованную порцию основного раствора нужно профильтровать.

Во избежание контаминации препарата рекомендуется перелить порцию, которая будет постоянно использоваться, в небольшой янтарный флакон с пипеткой. Доливайте каждый раз, когда заканчивается реагент.

Материалы для приготовления буферного раствора

С другой стороны, буферный раствор с pH 7,2 готовят следующим образом:

6,77 г фосфата натрия (безводного) (NaHPO ₄ ), 2,59 г дигидрофосфата калия (KH ₂ PO ₄ ) и дистиллированной воды отвешивают до 1000 см 3.

Окончательная подготовка красителя

Для приготовления окончательного окрашивающего раствора отмеряют 2 мл отфильтрованного исходного раствора и смешивают с 6 мл буферного раствора. Перемешайте смесь.

Следует учитывать тот факт, что методика приготовления окраски может меняться в зависимости от коммерческой компании.

Дополнительные материалы, необходимые для выполнения окраски

Помимо описанных материалов, у вас должны быть красящие перемычки, футболки с водой или буфером для стирки, предметные стекла или крышки для предметов, секундомер для контроля времени окрашивания и промокательная бумага или какой-либо материал, который можно использовать для сушки ( марля или вата).

Техника

Процесс окрашивания

1) Перед окрашиванием мазок образца должен быть готов на чистом предметном стекле.

Образцами могут быть кровь, костный мозг, гистологические срезы тканей или образцы шейки матки и влагалища. Рекомендуется, чтобы пасты были тонкими и просушивались 1-2 часа перед окрашиванием.

2) На раскрашивающий мост поместите все листы, которые нужно раскрасить. Вы всегда работаете в одном и том же порядке, и каждый лист четко обозначен.

3) Нанесите несколько капель 100% метилового спирта (метанола) на мазок и дайте ему действовать в течение 3-5 минут, чтобы зафиксировать и обезвожить образец.

4) Выбросьте метанол на листе и дайте ему высохнуть на воздухе.

5) После высыхания нанесите пипеткой последний окрашивающий раствор, пока не будет покрыт весь лист. Оставьте на 15 минут. Некоторые авторы рекомендуют до 25 мин. Это зависит от бизнес-дома.

6) Слейте воду с пятна и промойте мазок дистиллированной водой или буферным раствором 7.2.

7) На промокательной бумаге дайте просохнуть листам на открытом воздухе, расположив их вертикально с помощью подставки.

8) Очистите заднюю часть предметного стекла спиртовым или ватным тампоном, чтобы удалить все следы пятен.

коммунальные услуги

Техника окрашивания по Гимзе используется в различных областях, среди которых: гематология, микология, бактериология, паразитология, цитология и цитогенетика.

Гематология

Это пятно используется чаще всего. С его помощью можно идентифицировать каждую клетку, присутствующую в образцах костного мозга или периферической крови. А также оценка количества каждой серии, возможность обнаружить лейкоцитоз или лейкопению, тромбоцитопению и т. Д.

Поскольку он чувствителен к идентификации незрелых клеток, он важен для диагностики острых или хронических лейкозов. Также возможно диагностировать анемию, такую ​​как серповидно-клеточная анемия, серповидно-клеточная анемия и другие.

микология

В этой области его обычно используют для поиска Histoplasma capsulatum (внутриклеточный диморфный гриб) в образцах тканей.

бактериология

В гематологических мазках, окрашенных Giemsa, можно обнаружить Borrelias sp у пациентов с заболеванием, называемым рецидивирующей лихорадкой. Спирохеты широко распространены среди эритроцитов в образцах, взятых на пике лихорадки.

Также возможно визуализировать внутриклеточные бактерии, такие как Rickettsia sp и Chlamydia trachomatis, в инфицированных клетках.

паразитология

В области паразитологии окрашивание по Гимзе позволило диагностировать паразитарные заболевания, такие как малярия, болезнь Шагаса и лейшманиоз.

В первых двух паразитов Plasmodium sp и Trypanosoma cruzi соответственно можно увидеть в периферической крови инфицированных пациентов, они могут быть обнаружены на разных стадиях в зависимости от стадии заболевания.

Для улучшения поиска паразитов в крови рекомендуется использовать краситель Гимза, смешанный с красителем Мая-Грюнвальда.

Точно так же кожный лейшманиоз можно диагностировать путем оценки образцов биопсии кожи, окрашенных по Гимзе, в которых обнаружен паразит.

цитология

Окрашивание по Гимзе также используется для цитологического исследования эндоцервикальных образцов, хотя это не самый часто используемый метод для этой цели.

Но в случаях нехватки ресурсов его можно использовать, имея функциональные возможности, аналогичные тем, которые предлагает метод Папаниколау, и по более низкой цене. Однако это требует экспертизы со стороны экзаменатора.

Цитогенетика

Важной особенностью окрашивания по Гимзе является его способность прочно связываться с богатыми аденином и тимином участками ДНК. Это позволяет визуализировать ДНК во время митоза клетки в различных состояниях конденсации.

Эти исследования необходимы для обнаружения хроматических аберраций, таких как дупликации, делеции или транслокации различных участков хромосом.

Исследование, демонстрирующее эффективность красителя Гимзы

Cannova et al (2016) сравнили 3 метода окрашивания для диагностики кожного лейшманиоза.

Для этого они использовали образцы, полученные от экспериментального животного (Mesocrisetus auratus), экспериментально инокулированного лейшманиозами.

Авторы продемонстрировали, что окраска по Гимзе была лучше, чем окраска по Пап-март® и Гаффни. Поэтому они сочли краситель Гимзы идеальным для диагностики кожного лейшманиоза.

Превосходные результаты, полученные авторами, связаны с тем, что комбинация красителей, составляющих смесь Гимзы, создает необходимые условия для создания благоприятного контраста, позволяя четко различать структуры амастигот как внутриклеточно, так и внеклеточно.

Другие техники (Pap-mart® и Gaffney) тоже сделали то же самое, но более слабым способом и, следовательно, более трудным для визуализации. Вот почему краситель Гимза рекомендуется для паразитологической диагностики лейшманиоза.

Аналогичным образом, в исследовании Ramírez et al (1994) оценивалась достоверность окрашивания по Гимзе и Лендруму в мазках конъюнктивы для идентификации Chlamydia trachomatis.

Авторы определили, что окраска по Гимзе и Ледруму имеют одинаковую специфичность, но оказалось, что окраска по Гимзе более чувствительна.

Это объясняет, почему окраска по Гимзе в настоящее время наиболее часто используется для диагностики хламидийных инфекций, особенно при ограниченных ресурсах.

Источник: PanReac Applichem ITW Reagents. Пятно Гимзы. Версия 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Кастельяр-дель-Валлес, Испания.

Рекомендации по хорошему окрашиванию

Сушка листов не должна ускоряться. Следует ожидать разумного количества времени, чтобы высушить его на открытом воздухе. Примерно 2 часа.

Покрасьте сразу через 2 часа для достижения наилучших результатов.

Чтобы мазки лучше фиксировались и окрашивались, образец необходимо распределить на предметном стекле таким образом, чтобы оставался тонкий и однородный слой.

Предпочтительным образцом крови является капиллярный, поскольку мазок делается непосредственно из капли крови, и поэтому образец не содержит никаких добавок, что способствует сохранению клеточных структур.

Однако, если используется венозная кровь, в качестве антикоагулянта следует использовать ЭДТА, а не гепарин, поскольку гепарин обычно деформирует клетки.

Распространенные ошибки при окрашивании по Гимзе

В практике раскраски возможны ошибки. Об этом свидетельствуют резкие изменения тональности структур.

Чрезвычайно синяя окраска

Это может быть связано с:

• Очень густые мазки
• Превышение времени окрашивания
• Мыть недостаточно.
• Использование реагентов с уровнем pH выше нейтрального (щелочного).

В этих условиях цвета следующих структур искажаются таким образом, что эритроциты вместо окрашивания в лососево-розовый цвет становятся зелеными, гранулы эозинофилов, которые необходимо окрашивать в кирпично-красный цвет, становятся синеватыми или серыми и т. Д. отклонение в привычных тонах.

Чрезмерно розовая окраска

Это может быть связано с:

• Недостаточное время окрашивания.
• Продолжительное или чрезмерное мытье.
• Плохая сушка.
• Использование сильнокислых реагентов.

В этом конкретном случае структуры, которые обычно окрашиваются в синий цвет, не будут почти видны, в то время как структуры, окрашенные в розовый цвет, будут иметь сильно преувеличенные оттенки.

Пример: красные кровяные тельца станут ярко-красными или ярко-оранжевыми, ядерный хроматин станет бледно-розовым, а гранулы эозинофилов станут темно-ярко-красными.

Наличие осадков на мазке

Причины могут быть:

• Используйте грязные или плохо вымытые пленки.
• Не позволяйте мазку хорошо высохнуть.
• Слишком долго оставлять фиксирующий раствор.
• Недостаточная стирка по окончании окрашивания.
• Неадекватная фильтрация или отсутствие фильтрации используемого красителя.

Наличие морфологических артефактов

В мазках могут появляться морфологические артефакты, затрудняющие визуализацию и интерпретацию имеющихся структур. Это связано с:

• Тип используемого антикоагулянта, например гепарин.
• Использование грязной, испорченной или жирной пленки.

Режим хранения

После приготовления краситель нужно хранить при комнатной температуре (15-25 ° C), чтобы краситель не выпал в осадок. Хранить его следует в плотно закрытой янтарной таре.

Ссылки

1. Каннова Д., Брито Э. и Саймонс М. Оценка методов окрашивания для диагностики кожного лейшманиоза. Салус. 2016; 20 (2): 24-29.
2. Реагенты PanReac Applichem ITW. Пятно Гимзы. Версия 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Кастельяр-дель-Валлес, Испания.
3. Кларк Г. Процедуры окрашивания (1981), 4thed. Уильямс и Уилкинс.
4. Прикладная клиническая химия. Краситель Гимза для диагностики in vitro. Дистрибьютор: cromakit.es
5. Рамирес I, Мехия М., Гарсиа де ла Рива Дж., Гермес Ф. и Грациозо С. Действительность окрашивания по Гимзе и Лендруму в мазках конъюнктивы для выявления Chlamydia trachomatis. Бол Санит Панам. 1994; 116 (3): 212-216.
6. Касас-Ринкон Г. Общая микология. 1994. 2-е изд., Центральный университет Венесуэлы, Библиотечные издания. Венесуэла Каракас.
7. «Пятно Гимзы». Википедия, свободная энциклопедия. 1 сен 2017, 01:02 UTC. 6 декабря 2018 г., es.wikipedia.org.