ОКРАШИВАНИЕ СПОР: ОБОСНОВАНИЕ, МЕТОДЫ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ - БИОЛОГИЯ - 2025

Спор окрашивание является методологией , используемой для окрашивания сопротивления структур , которые образуют некоторые бактериальных родов , когда в неблагоприятных условиях; Эти структуры соответствуют форме выживания.

Есть много родов, образующих споры; однако основными из них являются Bacillus и Clostridium. Эти роды считаются более актуальными, поскольку имеют патогенные для человека виды.

Окрашивание спор методом Шеффера - Фултона или Виртца-Конклина. И тамбе (исходный загрузчик) с Wikimedia Commons

Каждая бацилла может дать начало споре. Во время окрашивания препарата спора может находиться внутри палочки (эндоспора) или вне ее (экзоспора). При обычных методах окрашивания бактерий, таких как окрашивание по Граму, споры остаются бесцветными.

В настоящее время существует несколько методик окрашивания, которые способны проникать в толстую структуру спор и окрашивать их. Эти методологии очень разнообразны; К ним относятся техника Дорнера, окраска Мёллера и методология Шеффера-Фултона, также известная как Виртц-Конклин.

Из всех упомянутых методов методология Шеффера-Фултона наиболее широко используется в рутинных лабораториях. Он назван в честь двух микробиологов, создавших окраску в 1930 году: Алисии Шеффер и Макдональда Фултона. Однако эту технику иногда называют Виртц-Конклин в честь двух бактериологов 1900-х годов.

основа

Споры не окрашиваются обычными пятнами, потому что у них очень толстая стенка. Сложный состав спор предотвращает проникновение большинства красителей.

Если исследовать спору снаружи внутрь, наблюдаются следующие слои: во-первых, это экзоспорий, который является самым тонким и внешним слоем, образованным гликопротеинами.

Далее идет кутикула, которая обеспечивает устойчивость к высоким температурам, за ней следует кора, состоящая из пептидогликана. Позже - стенка основания, защищающая протопласт.

Спора представляет собой обезвоженную структуру, содержащую 15% кальция и дипиколиновую кислоту. Таким образом, большинство методов окрашивания спор основано на приложении тепла, чтобы краситель мог проникнуть в толстую структуру.

Как только спора окрашивается, она не может удалить краситель. В методе Шеффера-Фултона малахитовый зеленый проникает в вегетативные клетки и при воздействии тепла проникает как в эндоспоры, так и в экзоспоры.

При промывании водой краситель удаляется из вегетативной клетки. Это происходит из-за того, что краситель малахитовый зеленый имеет слегка щелочную основу, поэтому он слабо связывается с вегетативными клетками.

Вместо этого он не может выйти из споры, и в конечном итоге бацилла окрашивается сафранином. Эта основа действительна для остальных техник, в которых происходит нечто подобное.

Методы окрашивания спор

Чтобы провести окрашивание спор, необходимо получить чистую культуру подозрительного штамма, который необходимо изучить.

Культуру подвергают воздействию экстремальных температур в течение 24 часов, чтобы стимулировать споруляцию микроорганизмов. Для этого культуру можно поместить в духовку при 44 ° C или в холодильник (8 ° C) на 24 или 48 часов.

Если оставить слишком долго при указанных температурах, будут наблюдаться только экзоспоры, так как все эндоспоры уже вышли из бациллы.

По истечении этого времени на чистое предметное стекло следует нанести несколько капель стерильного физиологического раствора. Затем берется небольшая порция культуры и делается мелкая намазка.

После этого его оставляют сохнуть, фиксируют на тепле и окрашивают одним из способов, описанных ниже:

Техника Дорнера

1- Приготовьте в пробирке концентрированную суспензию спорулированных микроорганизмов в дистиллированной воде и добавьте равный объем отфильтрованного фуксина киньюнкарбол.

2- Поместите трубку в ванну с кипящей водой на 5-10 минут.

3- На чистом предметном стекле смешайте каплю предыдущей суспензии с каплей 10% водного раствора нигрозина, прокипятите и профильтруйте.

4- Намажьте и быстро высушите на слабом огне.

5- Осмотрите с объективом 100X (погружение).

Споры окрашиваются в красный цвет, а бактериальные клетки кажутся почти бесцветными на темно-сером фоне.

Модифицированная техника Дорнера

1- Суспензию спорулированного микроорганизма наносят на предметное стекло и фиксируют в тепле.

2- Образец покрывают полосой фильтровальной бумаги, к которой добавлен карбол фуксин. Краситель нагревают от 5 до 7 минут с помощью пламени горелки Бунзена до образования паров. Затем бумага удаляется.

3- Препарат промывают водой, а затем сушат промокательной бумагой.

4- Покройте мазок тонкой пленкой 10% нигрозина, используя второе предметное стекло для распределения нигрозина или иглу.

Окраска, принимаемая спорами и бактериями, такая же, как описанная в предшествующем уровне техники.

Метод Шеффера - Фултона или Виртца-Конклина

1- Сделайте тонкий мазок суспензии спорообразующих микроорганизмов на предметном стекле и зафиксируйте на нагревании.

2- Покройте предметное стекло 5% водным раствором малахитового зеленого (вы можете поместить на предметное стекло фильтровальную бумагу).

3- Нагрейте пламя горелки Бунзена, чтобы вызвать выделение паров и погасить пламя. Повторяйте операцию в течение 6-10 минут. Если во время процедуры раствор малахитового зеленого испаряется слишком сильно, можно добавить еще.

4- Снимите фильтровальную бумагу (если она установлена) и промойте водой.

5. Накройте предметное стекло 0,5% водным сафранином на 30 секунд (в некоторых вариантах техники используется 0,1% водный сафранин и оставляют на 3 минуты).

При использовании этой техники споры становятся зелеными, а бациллы - красными.

Его недостаток заключается в том, что эндоспоры молодых культур плохо окрашиваются, поскольку они выглядят чрезвычайно прозрачными или бесцветными. Чтобы этого не произошло, рекомендуется использовать культуры 48-часовой инкубации.

Техника Мёллера

1- Покройте мазок хлороформом на 2 минуты.

2- Выбросьте хлороформ.

3- Покройте 5% хромовой кислотой на 5 минут.

4- Промыть дистиллированной водой.

5- Лист покрывают карбол фуксин-феникада и подвергают воздействию пламени горелки Бунзена до выделения паров; затем его снимают с пламени на несколько мгновений. Операция повторяется до истечения 10 минут.

6- Промыть водой.

7- Используйте подкисленный этанол (соляной спирт) для обесцвечивания. Его оставляют на 20 или 30 секунд.

8- Промыть дистиллированной водой.

9. Сделайте контраст, покрыв лист метиленовым синим на 5 минут.

10- Промыть дистиллированной водой.

11- Дайте ему высохнуть, и образец перенесут в микроскоп.

Споры кажутся красными, а бациллы - синими. Важно не вдыхать пары, так как они токсичны и в долгосрочной перспективе могут быть канцерогенными.

Модифицированная техника Мёллера без нагрева

В 2007 году Хаяма и его сотрудники создали модификацию техники Меллера. Они исключили этап нагревания красителя и заменили его добавлением 2 капель поверхностно-активного вещества Tergitol 7 на каждые 10 мл раствора карбол фуксин-карбол. Были получены такие же результаты.

Приложения

Окраска спор дает очень ценную и полезную информацию для идентификации патогена, поскольку его присутствие, форма, расположение в бацилле и способность деформировать вегетативную клетку или нет, являются данными, которые могут определять вид. вовлечены в определенный жанр.

В этом контексте стоит сказать, что споры могут быть круглыми или овальными, они могут располагаться в центре, а также в парацентральном, субминальном или конечном положении.

Схема формы и положения эндоспор и экзоспор

Примеры

- Clostridium difficile образует овальную спору в конечном положении, которая деформирует бациллу.

- Спора Clostridium tertium имеет овальную форму, не деформирует бациллу и находится на терминальном уровне.

- Эндоспора Clostridium tetani является терминальной и деформирует палочку, создавая вид голени.

- Споры Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy и C. septicum имеют округлую или субтерминальную овальную форму и деформируют палочку.

- Эндоспора Clostridium sordelli расположена в центре, с небольшой деформацией.

Конеман Э, Аллен С., Джанда В., Шрекенбергер П., Винн В. (2004). Микробиологическая диагностика. (5-е изд.). Аргентина, редакция Panamericana SA

Ссылки

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T., Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Предложение упрощенной техники окрашивания бактериальных спор без применения тепла - успешная модификация метода Меллера. Eur J Med Res.2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Авторы Википедии. Пятно Меллера. Википедия, свободная энциклопедия. 3 ноября 2018 г., 03:28 UTC. Доступно на: en.wikipedia.org
3. Перес Р., Хуарес М., Родригес (2011). Руководство лаборатории микробиологических методов. Отделение фундаментальных наук Академии микробиологии. Национальный политехнический институт.
4. «Эндоспора». Википедия, свободная энциклопедия. 25 февраля 2018 г., 10:20 UTC. 10 янв 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Сильва Л., Сильва С., Фернандес Н., Буэно С., Торрес Дж., Рико М., Масиас Дж. И соавторы. (2006). Трудовые кадры автономного сообщества Эстремадура. Конкретная повестка дня Том IV. Редакция MAD. Севилья-Испания, стр 211-212.
6. Сильва М., Гарсия М., Корралес Дж., Понсе Э. (2006). Техник-лаборант Галицкой службы здравоохранения (СЕРГАС). Конкретная тема повестки дня. Том 2. От редакции МАД. Севилья-Испания, стр 79-80.
7. Конеман Э, Аллен С., Джанда В., Шрекенбергер П., Винн В. (2004). Микробиологическая диагностика. (5-е изд.). Аргентина, редакция Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Микробиологическая диагностика Бейли и Скотта. 12 изд. Аргентина. Редакция Panamericana SA