MEDIO OF: ОБОСНОВАНИЕ, ПОДГОТОВКА, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ И ОГРАНИЧЕНИЯ - БИОЛОГИЯ - 2025

Среда для ферментации OF или глюкозы представляет собой полутвердый агар, специально разработанный для изучения окислительного и ферментативного метаболизма углеводов в важной группе микроорганизмов, отличных от Enterobacteriaceae, называемых неинтеральными грамотрицательными бациллами.

Он был создан Хью и Лейфсоном; Эти исследователи поняли, что обычные методы изучения производства кислоты из углеводов не подходят для этой конкретной группы бактерий.

A. Коммерческая базальная среда OF. B. Пробирки с засеянной средой OF. Источник: A и B Фотографии автора MSc. Мариельса Гил.

Это связано с тем, что неинтеральные грамотрицательные палочки обычно производят небольшое количество кислот, в отличие от Enterobacteriaceae.

В этом смысле среда OF обладает особыми характеристиками, которые позволяют обнаруживать небольшие количества кислоты, образованной как окислительным, так и ферментативным путями. Эти различия связаны с количеством пептонов, углеводов и агара.

Эта среда содержит меньше пептонов и более высокую концентрацию углеводов, таким образом уменьшая количество продуктов, подщелачивающих среду в результате метаболизма белков и увеличивая производство кислот из-за использования углеводов.

С другой стороны, уменьшение количества агара способствует распространению продуцируемой кислоты по среде, помимо того, что позволяет нам наблюдать подвижность.

Среда OF состоит из пептона, хлорида натрия, бромтимолового синего, дикалийфосфата, агара и углевода. Наиболее распространенный углевод - это глюкоза, но можно использовать и другие углеводы, в зависимости от того, что нужно изучать, например, лактозу, мальтозу, ксилозу и другие.

основа

Как и любая питательная среда, среда OF должна содержать питательные вещества, гарантирующие рост бактерий; эти вещества - пептоны.

Со своей стороны, углевод обеспечивает энергию и в то же время служит для изучения поведения микроорганизма по отношению к нему, то есть позволяет классифицировать бактерии как окислительные, ферментативные или несахаролитические организмы.

Среда OF содержит соотношение пептон / углевод 1: 5 в отличие от обычных сред 2: 1. Это гарантирует, что количество щелочных аминов, образующихся при разложении пептонов, не нейтрализует образование слабых кислот.

С другой стороны, среда содержит хлорид натрия и дикалий фосфат. Эти соединения осмотически стабилизируют среду и соответственно регулируют pH. Бромтимоловый синий - это индикатор pH, который меняет цвет среды с зеленого на желтый с образованием кислоты.

Некоторые микроорганизмы могут использовать углеводы путем окисления или ферментации, в то время как другие не используют оба пути.

Это зависит от характеристик каждого микроорганизма. Например, некоторые строго аэробные микроорганизмы могут окислять определенные углеводы, а факультативные анаэробы могут окисляться и ферментировать в зависимости от окружающей среды, в то время как другие не окисляют и не ферментируют углеводы (асакаролитические).

Наконец, существует модификация среды OF, рекомендованная CDC, которая содержит специальную основу OF с феноловым красным в качестве индикатора.

Процесс окисления

Процесс окисления глюкозы не требует фосфорилирования глюкозы, как и процесс ферментации. В этом случае альдегидная группа окисляется до карбоксильной группы с образованием глюконовой кислоты. Это, в свою очередь, окисляется до 2-кетоглюконовой кислоты.

Последний либо накапливает, либо распадается на две молекулы пировиноградной кислоты. Эта система требует присутствия кислорода или какого-либо неорганического соединения в качестве конечного акцептора электронов.

Производство кислот по этому пути слабее, чем по способу ферментации.

Процесс ферментации

Чтобы ферментация глюкозы происходила любым из доступных путей, она должна сначала фосфорилироваться, превращаясь в глюкозо-6-фосфат.

Ферментация глюкозы может происходить по нескольким маршрутам, основным из которых является маршрут Эмбден-Мейерхоф-Парнас, но они также могут идти по маршруту Энтнера-Дудорова или по маршруту Варбурга-Диккенса гексозо-монофосфат, также известный как деградации пентоз.

Выбранный путь будет зависеть от ферментативной системы, которой обладает микроорганизм.

Виа Эмбден-Мейерхоф-Парнас

При ферментации глюкозы по пути Эмбдена-Мейерхофа-Парнаса она расщепляется на две молекулы триозы, которые позже разлагаются до различных углеродных соединений, до образования глицеральдегид-3-фосфата. Отсюда происходит промежуточное вещество - пировиноградная кислота.

Оттуда будут образовываться различные типы смешанных кислот, которые могут варьироваться от одного вида к другому.

Эта система существует в отсутствие кислорода и требует органического соединения в качестве конечного акцептора электронов.

Путь Энтнера-Дудорова

При ферментации глюкозы по пути Энтнера-Дудорова глюкозо-6-фосфат становится глюконо-ᵼ-лактон-6-фосфатом, а оттуда он окисляется до 6-фосфоглюконата и 2-кето-3-дезокси-6- фосфоглюконат с образованием пировиноградной кислоты. Этот путь действительно требует кислорода для гликолиза.

Путь деградации пентозов или монофосфатный путь Варбурга-Диккенса Hexoxa

Этот маршрут является гибридом двух указанных выше. Он начинается аналогично пути Энтнера-Дудорова, но позже образуется глицеральдегид-3-фосфат в качестве предшественника пировиноградной кислоты, как это происходит в пути Эмбден-Мейерхоф-Парнас.

подготовка

Весить:

2 г пептона

5 г хлорида натрия

10 г D-глюкозы (или углеводов, которые нужно приготовить)

0,03 г бромтимолового синего

3 г агара

0,30 г дикалия фосфата

1 литр дистиллированной воды.

Смешайте все соединения, кроме углеводов, и растворите в 1 литре дистиллированной воды. Нагрейте и взболтайте до полного растворения.

После охлаждения до 50 ° C добавляют 100 мл 10% глюкозы (фильтрованной).

С соблюдением правил асептики распределите 5 мл среды OF в закрытые хлопком пробирки и автоклавируйте при 121 ° C и давлении 15 фунтов в течение 15 минут.

Дать застыть в вертикальном положении.

PH среды должен составлять 7,1, цвет приготовленной среды - зеленый.

Хранить в холодильнике.

Приложения

Среда OF - это специальная среда для определения метаболического поведения микроорганизма в отношении углеводов. Особенно для тех, которые образуют мало, слабую или не образуют кислот.

Посевная

Для каждого микроорганизма необходимы 2 пробирки OF, обе должны быть инокулированы исследуемым микроорганизмом. Колонию берут прямой ручкой и в центре пробирки делают прокол, не доходя до дна; Можно сделать несколько проколов, если нет интереса к наблюдению за моторикой.

В одну из пробирок добавляют слой стерильного жидкого вазелина или стерильного расплавленного парафина (примерно от 1 до 2 мл) и маркируют буквой «F». Другая трубка остается оригинальной и имеет маркировку «O». Обе пробирки инкубируют при 35 ° C и наблюдают ежедневно в течение 3-4 дней.

интерпретация

Обмен веществ и производство газа

Таблица: Классификация микроорганизмов по их поведению в открытых (окислительных) и закрытых (ферментативных) пробирках

Источник: Сделано автором MSc. Мариельса Гиль

Наблюдается газ с образованием пузырьков или вытеснением агара.

Следует отметить, что организм, который только окисляет глюкозу, но не ферментирует ее, не сможет ферментировать другие углеводы, в любом случае он будет только окислять ее. Поэтому в этой ситуации герметичная пробирка для исследования других углеводов не используется.

подвижность

Кроме того, в среде OF можно увидеть подвижность.

Положительная подвижность : рост, не ограниченный областью инокуляции. По бокам трубки наблюдается рост.

Отрицательная подвижность : рост только в исходном посевном материале.

контроль качества

Следующие штаммы могут использоваться для контроля качества: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Moraxella sp. Ожидаемые результаты:

1. coli: ферментер глюкозы (желтые и игристые пробирки).
2. aeruginosa: окислитель глюкозы (открытая желтая пробирка и зеленая или синяя печать).
3. Moraxella sp: Несахаролитик (зеленая или синяя открытая пробирка, зеленая закрытая пробирка).

Ограничения

-Некоторые микроорганизмы не могут расти в среде OF. В этих случаях тест повторяют, но в среду добавляют 2% сыворотки или 0,1% дрожжевой экстракт.

- Реакции окисления часто наблюдаются только вблизи поверхности, а остальная часть среды может оставаться зеленой, так же как и считается положительной.

Ссылки

1. Конеман Э, Аллен С., Джанда В., Шрекенбергер П., Винн В. (2004). Микробиологическая диагностика. 5-е изд. Редакция Panamericana SA Аргентина.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Микробиологический диагноз Бейли и Скотта. 12 изд. Редакция Panamericana SA Аргентина.
3. Мак Фаддин Дж. (2003). Биохимические тесты для идентификации бактерий, имеющих клиническое значение. 3-е изд. Редакция Panamericana. Буэнос айрес. Аргентина.
4. Лаборатории Франсиско Сориа Мельгисо. 2009. Глюкозная среда. Доступно на: http://f-soria.es
5. Conda Pronadisa Laboratories. Глюкозная среда. Доступно на: condalab.com
6. BD Laboratories. 2007. OF Basal Medium. Доступно на: bd.com