ОТВАР МОЧЕВИНЫ: ОСНОВА, ПРИГОТОВЛЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ - БИОЛОГИЯ - 2025

Бульон мочевины представляет собой жидкая культуральная среда, используется для обнаружения присутствия фермента уреазы в некоторых микроорганизмах. Уреаза - это микробный фермент, который продуцируется конститутивным путем, то есть синтезируется независимо от того, присутствует ли субстрат, на который она действует.

Функция уреазы связана с разложением органических соединений. Не все микроорганизмы способны синтезировать этот фермент, поэтому его определение в лаборатории позволяет идентифицировать определенные штаммы бактерий и даже различать виды одного рода.

Отрицательный и положительный тест на мочевину. Источник: Фотография автора MSc. Мариельса Гил.

Есть два типа теста на мочевину: Стюарт и Кристенсен. Они различаются по составу и чувствительности. Первый особенный, чтобы показать большое количество уреазы, продуцируемой видами рода Proteus.

Второй более чувствителен и может обнаруживать небольшие количества уреазы, поздно генерируемой другими видами бактерий, такими как Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter и Mycobacterium.

Бульон мочевины Стюарта состоит из мочевины, хлорида натрия, дикалийфосфата, монокалиевого фосфата, дрожжевого экстракта, фенолового красного и дистиллированной воды.

Между тем, бульон или агар мочевины Кристенсена состоит из пептонов, хлорида натрия, монокалиевого фосфата, глюкозы, мочевины, фенолового красного, дистиллированной воды и агар-агара. Последнее только в том случае, если это твердая среда.

основа

Фермент уреаза гидролизует мочевину с образованием диоксида углерода, воды и двух молекул аммиака. Эти соединения реагируют с образованием конечного продукта, называемого карбонатом аммония.

Отвар мочевины Стюарта

Бульон мочевины Стюарта более забуференный с pH 6,8. Следовательно, микроорганизм должен уметь образовывать большие количества аммиака, чтобы красить фенол. PH должен подняться выше 8.

Следовательно, бульон с мочевиной Стюарта является селективным для видов Proteus, давая положительные результаты в течение 24-48 часов после инкубации, и неэффективен для бактерий, которые производят небольшое количество уреазы или которые медленно гидролизуют мочевину.

Это связано с тем, что виды Proteus могут использовать мочевину в качестве источника азота. Вместо этого другим бактериям, продуцирующим уреазу, нужен дополнительный источник.

Однако Pérez et al. (2002) определили, что бульон с мочевиной Стюарта столь же эффективен, как и агар с мочевиной Кристенсена, для определения уреазы в штаммах дрожжей родов Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon и Saccharomyces.

Авторы исследования утверждают, что достигли 100% согласия с обеими средами (Стюарт и Кристенсен) при инкубации в течение 24 и 48 часов; за исключением того, что штаммы, которым удалось превратить среду в сильный розовато-фуксийный цвет, были приняты как положительные.

Это уточнение необходимо, поскольку Лоддер (1970) заявил, что почти всем дрожжам удается придать скосу агара с мочевиной Кристенсена бледно-розовый цвет. Это связано с тем, что они могут гидролизовать мочевину в минимальных количествах, и с образованием аминов путем окислительного декарбоксилирования аминокислот на поверхности. Это не следует рассматривать как положительное.

Агар или бульон с мочевиной Кристенсена

Бульон или агар мочевины Кристенсена менее забуферены, что позволяет обнаруживать небольшие количества аммиака. Кроме того, эта среда обогащена пептонами и глюкозой. Эти соединения вызывают рост других продуцирующих уреазу микроорганизмов, которые не растут в бульоне Стюарта.

Аналогичным образом, тест на мочевину Кристенсена дает более быстрые результаты, особенно для Proteus, поскольку дает положительный результат всего за 30 минут как минимум и до 6 часов как максимум.

Остальным микроорганизмам, продуцирующим уреазу, удается слегка изменить цвет среды через 6 часов и сильно через 24, 48, 72 часа или более, и даже некоторые штаммы могут давать слабые реакции через 5 или 6 дней.

Интерпретация обоих СМИ (Стюарт и Кристенсен)

Изначально среда имеет желто-оранжевый цвет, и при положительной реакции цвет среды изменится на розовато-фуксийный. Интенсивность цвета прямо пропорциональна количеству произведенного аммиака.

Отрицательная реакция оставит среду первоначального цвета, за исключением дрожжей, которые могут стать бледно-розовыми в среде агара с мочевиной Кристенсена.

подготовка

Отвар мочевины Стюарта

Взвесьте необходимые граммы согласно показаниям коммерческой компании. Растворить предпочтительно в стерильной дистиллированной воде. Не используйте тепло для растворения, так как мочевина чувствительна к нагреванию.

Для стерилизации используется мембранная фильтрация. Для этого используется фильтр Millipore с диаметром пор 0,45 мкм. Не используйте автоклав. После фильтрации раствор распределяется по стерильным пробиркам. Для получения надежных результатов его следует переносить от 1,5 мл как минимальное количество до 3 мл как максимальное количество на пробирку.

Хранить в холодильнике и прогревать перед использованием.

Если метод фильтрации недоступен, среду следует использовать немедленно для получения надежных результатов.

Другой способ приготовления бульона мочевины Стюарта заключается в следующем:

Некоторые коммерческие предприятия продают базовую среду для теста на мочевину, за исключением мочевины.

Количество, указанное коммерческой компанией, взвешивается. Его растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют в автоклаве при 121 ° C в течение 15 минут. Оставляют немного постоять и, когда среда нагревается, добавляют 100 мл раствора мочевины, приготовленного на 20% и стерилизованного фильтрацией.

Распространяется в стерильных пробирках, как описано ранее.

Агар или бульон с мочевиной Кристенсена

-Приготовление раствора мочевины

Взвешивают 29 г обезвоженной мочевины и растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Для стерилизации используйте метод фильтрации. Не автоклавировать.

-Агар на основе мочевины

Растворите 24 г обезвоженного основного агара в 950 мл дистиллированной воды. Стерилизовать в автоклаве при 121 ° C в течение 15 минут. Дайте ему постоять, пока температура не достигнет 50 ° C, и добавьте мочевину, предварительно приготовленную в асептических условиях.

Разлить по 4-5 мл в стерильные пробирки и наклонить до твердого состояния. Клюв должен быть длинным.

Эта среда также может быть приготовлена ​​в жидкой форме.

Приложения

Тест на мочевину чрезвычайно эффективен для отличия рода Proteus от других родов семейства Enterobacteriaceae, учитывая быструю реакцию, обеспечиваемую Proteus.

Используя композицию Кристенсена, тест помогает различать виды одного и того же рода. Например, S. haemolyticus и S. warneri являются коагулазонегативным и бета-гемолитическим стафилококком, но отличаются тем, что S. haemolyticus отрицательно влияет на мочевину, а S. warneri - на мочевину.

С другой стороны, МакНалти успешно использовал 2% бульон Кристенсена с мочевиной для изучения присутствия Helicobacter pylori в образцах биопсии, взятых из слизистой оболочки желудка (антральная область).

Присутствие H. pylori подтверждается положительным результатом теста на мочевину. Время, необходимое для наблюдения за результатами, прямо пропорционально количеству присутствующих микроорганизмов.

Как видно, это простой метод диагностики Helicobacter pylori при биопсии желудка.

Наконец, этот тест также полезен для дифференциации видов из родов Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus и Mycobacteria.

Посев пробы мочевины

Оба метода требуют сильного микробного посева для оптимизации результатов. Бактериальные колонии предпочтительно берут с кровяного агара, а дрожжи - с агара Сабуро, за некоторыми исключениями. Посевной материал эмульгируют в жидкой среде.

Для бульона с мочевиной Стюарта инкубируйте при 37 ºC в течение 24–48 часов, зная, что вы ищете штаммы Proteus только тогда, когда штамм является бактерией. Для дрожжей его можно инкубировать при 37 ° C или при комнатной температуре в течение 24-48 часов инкубации.

В случае бульона с мочевиной Кристенсена его инкубируют при 37 ºC в течение 24 часов. Если тест отрицательный, его можно инкубировать до 6 дней. Если результат теста положительный до 6 часов, это означает, что это штамм рода Proteus.

В случае агара с мочевиной Кристенсена скошенная кромка агара сильно засевается без проколов. Бульон инкубируется и интерпретируется таким же образом.

контроль качества

Контрольные штаммы, такие как Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 и Salmonella typhimurium, можно использовать для тестирования среды. Первые два должны дать положительный результат, а последние два - отрицательный.

Источник: Конеман Э., Аллен С., Янда В., Шрекенбергер П., Винн В. (2004). Микробиологическая диагностика. 5-е изд. Редакция Panamericana SA Аргентина.

Ссылки

1. Перес К., Гойтия К., Мата С., Хартунг С., Колелла М., Рейес Х. и др. Использование бульона с мочевиной Стюарта для теста на уреазу в качестве теста для диагностики дрожжевых грибков. Преподобный Soc. Ven. Microbiol. 2002; 22 (2): 136-140. Доступно на: Scielo.org.
2. Мак Фаддин Дж. (2003). Биохимические тесты для идентификации бактерий, имеющих клиническое значение. 3-е изд. Редакция Panamericana. Буэнос айрес. Аргентина.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Микробиологический диагноз Бейли и Скотта. 12 изд. Редакция Panamericana SA Аргентина.
4. Конеман Э, Аллен С., Джанда В., Шрекенбергер П., Винн В. (2004). Микробиологическая диагностика. 5-е изд. Редакция Panamericana SA Аргентина.
5. Britannia Laboratories. Christensen Medium (агаровая база с мочевиной), 2015 г. Доступно на: britanialab.com