АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТА: ЕДИНИЦЫ, ИЗМЕРЕНИЕ, РЕГУЛЯЦИЯ И ФАКТОРЫ - ХИМИЯ - 2026

Ферментативная активность является способом выразить количество присутствующего фермента в данный момент времени. Указывает количество субстрата, превращенного в продукт за счет каталитического действия фермента за единицу времени.

На него влияют условия, в которых происходит ферментативная реакция, поэтому обычно это температура, при которой она измеряется. Но что такое ферменты? Они представляют собой биологические катализаторы, способные увеличивать скорость реакции без необратимых изменений во время катализированного процесса.

Ананас или ананас, фрукт, содержащий фермент бромелайн и, следовательно, обладающий высокой ферментативной активностью. Источник: H. Zell.

Ферменты, как правило, представляют собой белки, за исключением рибосом, молекулы РНК с ферментативной активностью.

Ферменты увеличивают скорость реакции за счет снижения энергетического барьера (энергии активации); который должен быть истек, чтобы достичь переходного состояния, и, таким образом, происходит реакция.

Молекулы субстрата, которые достигают переходного состояния, претерпевают структурные изменения, которые приводят к образованию молекул продукта. В зависимости от выполняемых ими функций ферменты подразделяются на шесть больших групп: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы.

Например, ферменты бромелайн и папаин представляют собой протеолитические ферменты (гидролазы), содержащиеся в ананасе или ананасе и папайе или папайе соответственно.

Известно, что и ананас, и папайя облегчают процесс пищеварения, поскольку, воздействуя на содержащиеся в них протеолитические ферменты, они помогают переваривать белки, то есть мяса и злаков.

Единица активности фермента

Единица фермента (МЕ) - это количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за одну минуту.

Впоследствии Международная система единиц (СИ) определила единицу активности фермента как количество фермента, которое превращает 1 моль субстрата в продукт в секунду. Этот агрегат получил название катал (кат).

1 моль = 10 ⁶ мкмоль и 1 минута = 60 секунд.

Следовательно, 1 катал равняется 60 · 10 ⁶ МЕ. Поскольку катал является большой единицей, часто используются меньшие единицы, такие как микрокатал (µkat), 10 ^-6 катал, и нанокатал (πkat), 10 ^-9 катал.

Специфическая деятельность

Это количество единиц активности фермента, деленное на миллиграммы белка в тестируемом образце. Удельная активность напрямую связана со степенью очистки фермента.

Как измеряется активность фермента?

Есть несколько методов определения активности фермента. Выбор конкретного метода будет зависеть от цели ферментного анализа; применимость метода; доступ к оборудованию, необходимому для проведения эксперимента; стоимость использования определенного метода и т. д.

Существуют спектрофотометрические, флуориметрические, хемилюминесцентные, калориметрические, радиометрические и хроматографические методы.

Спектрофотометрические методы могут быть колориметрическими и считываться в ультрафиолетовой (УФ) области электромагнитного излучения.

-Колориметрический метод

Он основан на создании хромофора под действием ферментов. Активность ферментов можно отслеживать непрерывно или периодически.

Непрерывная форма

В непрерывной форме реагенты помещаются в кювету спектрофотометра на желаемой длине волны, которая соответствует той, на которой хромофор имеет максимальное значение оптической плотности; и что, кроме того, нет никакого вмешательства в другое вещество, которое может образоваться.

Ферментативная реакция инициируется добавлением образца, содержащего фермент, активность которого необходимо определить. Одновременно запускается секундомер, и время от времени фиксируется значение оптической плотности.

Поскольку эквивалентность оптической плотности молям субстрата или продукта ферментативного действия известна, в зависимости от используемой методики можно рассчитать количество израсходованных или произведенных молей субстрата.

Кроме того, поскольку время, прошедшее с момента ферментативной реакции, было измерено, можно получить количество молей, потребляемых или производимых за секунду. Таким образом, ферментативная активность устанавливается в катальных единицах.

Прерывистая форма

В пакетной форме для определения ферментативной активности пробирки с компонентами реакции, за исключением образца, содержащего фермент или другой компонент, помещают в ванну с температурой 37ºC. Затем начинается реакция с добавления недостающего компонента.

Время, указанное в методике, дается пройти, и реакция останавливается добавлением соединения, которое останавливает реакцию. В этот момент считывают оптическую плотность и, наконец, проводят таким же образом, как и при непрерывном определении ферментативной активности.

-Метод снятия показаний в ультрафиолете

Кофермент никотинамидадинуклеотид, например, имеет две формы: НАДН (восстановленный) и НАД ⁺ (окисленный). Точно так же кофермент никотинамитинуклеотидфосфат имеет две формы НАДФН и НАДФ ⁺ , восстановленную и окисленную соответственно.

И восстановленная, и окисленная формы кофермента считываются на длине 260 нм из ультрафиолетового света; в то время как только восстановленные формы считываются на длине 340 нм из ультрафиолета.

Следовательно, как в реакциях окисления, так и в реакциях восстановления, в которых участвуют названные коферменты, они считываются при 340 нм.

Определение ферментативной активности, по сути, такое же, как и при непрерывной форме колориметрического метода; за исключением того, что оптическая плотность при 340 нм считывается для наблюдения за образованием НАДН или НАДФН или для измерения потребления этих коферментов.

Это будет зависеть от того, является ли измеряемая реакция окислением или восстановлением. Посредством соответствия между оптической плотностью и молями NADH и NADPH, в зависимости от обстоятельств, ферментативная активность может быть рассчитана путем деления молей кофермента на прошедшее время в секундах.

Регулирование активности ферментов

Контроль на уровне субстрата или продукта

По мере увеличения концентрации субстрата увеличивается активность фермента. Но при определенной концентрации субстрата активный центр или активные центры фермента насыщаются, так что активность фермента становится постоянной.

Однако продукт ферментативного действия может также взаимодействовать с активными центрами фермента, вызывая ингибирование ферментативной активности.

Продукт может действовать как конкурентный ингибитор; например, можно упомянуть фермент гексокиназу. Этот фермент производит фосфорилирование глюкозы с образованием глюкозо-6-фосфата, соединения, которое при накоплении ингибирует гексокиназу.

Контроль обратной связи

Может случиться так, что группа ферментов (A, B, C, D, E и F) действуют последовательно в метаболическом пути. Фермент B использует продукт фермента A в качестве субстрата и так далее.

Клетка, в зависимости от своих метаболических требований, может активировать или ингибировать последовательность ферментативной активности. Например, накопление продукта фермента F может действовать путем ингибирования фермента A или любого другого фермента в последовательности.

Аллостерические ферменты

Фермент может состоять из нескольких субъединиц, каждая со своими соответствующими активными центрами. Но эти субъединицы не действуют независимо, поэтому активность одной из субъединиц может активировать или подавлять действие остальных.

Хотя гемоглобин не считается ферментом, он представляет собой великолепную модель явления аллостеризма. Гемоглобин состоит из четырех белковых цепей, двух α-цепей и двух β-цепей, каждая из которых присоединена к гемовой группе.

Между субъединицами могут возникать два явления: гомоалостеризм и гетероалостеризм.

Homoalosterism

Связывание субстрата с одной из субъединиц увеличивает сродство других субъединиц к субстрату, в свою очередь, увеличивая ферментативную активность каждой из оставшихся субъединиц.

Точно так же ингибирование ферментативной активности одной из субъединиц вызывает такой же эффект для остальных.

В случае гемоглобина связывание кислорода с гемовой группой одной из белковых цепей вызовет увеличение авидности кислорода в остальных цепях.

Точно так же высвобождение кислорода из гемовой группы вызывает высвобождение кислорода из оставшихся групп белковых цепей.

Heterolosterism

Связывание активирующего или ингибирующего вещества, отличного от субстрата, с одной из субъединиц будет вызывать активацию или ингибирование ферментативной активности в других субъединицах.

В случае гемоглобина связывание гемовой группы H ⁺ , CO ₂ и 2,3-дифосфоглицерата с одной из субъединиц снижает сродство гемовой группы к кислороду, вызывая его высвобождение. Это выделение кислорода также производится в других цепях гемоглобина.

Факторы, влияющие на активность ферментов

-Концентрация субстрата

По мере увеличения концентрации субстрата увеличивается и активность фермента. Это связано с повышенным доступом молекул субстрата к активным центрам фермента.

Но для данной концентрации субстрата все активные центры фермента насыщаются им, в результате чего ферментативная активность не увеличивается, даже если концентрация субстрата увеличивается.

-pH от ферментативной реакции

Ферменты имеют оптимальный pH, при котором сродство фермента к субстрату является самым высоким. При этом pH достигается максимальное значение ферментативной активности.

Избыточная кислотность или основность среды может вызвать денатурацию фермента, в результате чего снижается его активность.

Профиль pH активности фермента варьируется. Так, например, пепсин имеет максимальную активность между 1-2 единицами pH; трипсин имеет оптимальный pH 8; а папаин имеет постоянную активность в диапазоне pH от 4 до 8.

-Температура ферментативной реакции

Активность ферментов увеличивается с повышением температуры. Как правило, активность фермента удваивается на каждые 10 градусов увеличения, пока не будет достигнута оптимальная температура для активности фермента.

Однако при превышении оптимальной температуры активность фермента имеет тенденцию к снижению по мере увеличения температуры реакции. Это связано с тем, что белки, а значит и ферменты, подвергаются денатурации из-за чрезмерного повышения температуры.

-Ионная концентрация реакции

Как правило, ферменты обладают оптимальной активностью в диапазоне концентраций от 0 до 500 ммоль / л. Однако при более высоких концентрациях активность фермента имеет тенденцию к снижению.

В этих условиях блокируются определенные ионные взаимодействия ферментов, необходимые для их максимальной активности.

Ссылки

1. Сегель, IH (1975). Биохимические расчеты. (2- ^е издание). John Wiley & Sons, INC
2. Ленингер, А.Л. (1975). Биохимия. (2- ^е издание). Worth Publishers, inc.
3. Мэтьюз, К. К., ван Холде, К. Э. и Ахерн, К. Г. (2002). Биохимия. (3 ^ра -е издание). Пирсон Аддисон Уешли.
4. Wikipedia. (2019). Ферментный анализ. Получено с: en.wikipedia.org
5. Гонсалес Хуан Мануэль. (SF). Кинетический фермент. Курс биомолекул. Получено с: ehu.eus