ПЯТНО РАЙТА: ОБОСНОВАНИЕ, МАТЕРИАЛЫ, ТЕХНИКА И ПРИМЕНЕНИЕ - БИОЛОГИЯ - 2025

Райт пятно представляет собой метод окрашивания , созданный американским патологоанатом Джеймс Homer Райт в 1902 году, на основе красителя Романовского. Поскольку окраска по Романовскому была нестабильной, Райт включил метанол в качестве растворителя и фиксатора.

Эта окраска является полихромной, что означает, что она дает несколько цветов в зависимости от структуры, впитывающей краситель. Этот метод окрашивания широко используется для выполнения дифференциального подсчета лейкоцитов и для изучения морфологии красных кровяных телец, тромбоцитов и лейкоцитов в периферической крови и костном мозге.

Различные мазки периферической крови с окраской по Райту. A. Острый лейкоз B. Plasmodium vivax в эритроците. C. Plasmodium falciparum, макрогаметоцит. D. Лимфоцит

Его применение очень важно, так как в различных клеточных линиях крови можно увидеть аномалии, что облегчает диагностику таких заболеваний, как лейкемия, бактериальные или паразитарные инфекции.

Возможно, это наиболее распространенные приложения, в которых используется этот метод, однако они не единственные. Он также полезен для других образцов, помимо крови и костного мозга, таких как выделения из носа, фекальная слизь, мокрота, образцы кожи и другие.

Обоснование пятен Райта

Пятно Райта возникло из пятна Романовского, которое состоит из раствора кислотного красителя (эозин Y) и основного красителя (метиленовый синий) и продуктов их окисления в метиловом спирте.

Смесь красителей, используемая для окрашивания Райта, вызывает эффект, известный как Романовский, то есть придает красивую фиолетовую окраску ядрам лейкоцитов и нейтрофильных гранул, в то время как красные кровяные тельца окрашиваются в розовый цвет.

Компонентами, отвечающими за формирование типичной цветовой гаммы красителя Райта, являются синий B и эозин Y. Наблюдаемый эффект будет зависеть от связывания красителей с химическими структурами и взаимодействия синего B и эозина Y.

Кислотные структуры, такие как нуклеиновые кислоты, ядерные белки и реактивная незрелая цитоплазма некоторых типов клеток, фиксируют синий цвет B (основное окрашивание).

В то время как основные структуры, такие как гемоглобин, гранулы сегментированных эозинофилов, среди других клеточных структур, фиксируют эозин Y (кислотный краситель).

На результат окрашивания могут влиять различные факторы, такие как pH красителя Райта, буфер и промывочный раствор; а также время окрашивания и фиксации.

Поэтому каждый этап подготовки реагентов имеет решающее значение и должен выполняться с вниманием к каждой детали.

материалы

Пятно Райта. На 100 мл требуется:

Взвесьте 0,3 г красителя Райта, отмерьте 97 мл метанола и 3 мл глицерина.

подготовка

В ступку поместите большое количество красителя Райта и постепенно добавляйте глицерин до полного растворения порошка.

Затем добавляют метанол, перемешивают и переливают в янтарную бутыль.

Перед применением раствор следует легкими движениями взболтать и процедить.

Буферный буферный раствор

В один литр дистиллированной воды добавляют 3,76 г гидрофосфата динатрия (Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ 0) плюс 2,1 г дигидрофосфата калия (KH ₂ PO ₄ ).

Очень хорошо перемешайте до растворения всех включенных реагентов. Довести pH до 7,2. Перелейте в стеклянную банку и храните при комнатной температуре.

Дополнительные материалы, необходимые для выполнения окраски

Кроме того, для выполнения техники окрашивания требуются другие материалы, а именно: предметные стекла или крышки, мостик для окрашивания, футболки с водой или буфером для стирки, секундомер для сохранения времени окрашивания и немного материала для сушки. (впитывающая бумага, марля или вата).

Компоненты морилки Райта

Метанол

Спирт (метанол) служит фиксатором мазка крови на предметном стекле.

В основном это реагент, восстанавливающий, обезвоживающий и фиксирующий коагулянт. Следовательно, его функция состоит в том, чтобы коагулировать белки и сделать их нерастворимыми, но без их фактической денатурации.

Метанол является наиболее широко используемым реагентом для фиксации мазка во всех лабораториях, поскольку он дает лучшие результаты, чем этанол. Идеальная концентрация - 99%.

Демпфер

Буфер (забуференный раствор) выполняет функцию регулирования или поддержания pH красителя, поскольку pH, доведенный до 7,2, необходим для того, чтобы клеточные структуры могли должным образом поглощать красители.

С другой стороны, стадия фиксации метанолом обезвоживает клетки, а буфер помогает их регидратировать.

Эосин (Y)

Эозин имеет сродство со строительными блоками, потому что это кислотный краситель. Известно, что два типа эозина очень похожи друг на друга, настолько, что можно использовать любой из них, получая одинаковый результат.

Один называется эозином Y, желтым эозином или тетрабромофлуоресцеином, а другой - эозином B, голубоватым эритрозином B или дибромодинитрофлуоресцеином. Однако чаще всего используется эозин Y.

Самым важным свойством этого красителя является его отрицательная полярность, что делает его привлекательным для положительно заряженных клеточных структур.

Метиленовый синий

Это основная окраска. Его основное свойство - метахромазия, то есть не все структуры будут окрашены в один цвет, это зависит от химического состава окрашиваемых структур.

Некоторые станут светло- или темно-синими, а некоторые станут темно-фиолетовыми или бледно-лиловыми.

Техника

1-Выполните распространение образца так, чтобы осталась тонкая пленка либо на предметном стекле, либо на покровном стекле.

2-Дайте ему высохнуть на воздухе примерно 2 часа.

3-Поместите сухой мазок на мостик для окрашивания или лоток для окрашивания так, чтобы образец был направлен вверх.

4-Покройте лист морилкой Райта по каплям, пока не будет покрыта вся поверхность. Оставьте на 5-8 минут.

5-Пятно должно полностью покрывать предметное стекло, не выходя за края. Если за время окрашивания он начнет испаряться, добавьте еще несколько капель.

6-Затем добавьте такое же количество амортизатора, немного подуйте, пока не появится характерный металлический блеск. Время от 10 до 15 минут.

7-Вымойте водой из-под крана, поднося легкую струю, пока лист не станет розовым.

8-С помощью марли, смоченной спиртом, удалите краситель, прилипший к задней части предметного стекла.

9-Дайте мазку хорошо высохнуть перед тем, как нанести иммерсионное масло для просмотра под микроскопом.

Утилита

Гематология

Он идеально подходит для окрашивания мазков периферической крови, исследования толстых мазков крови и исследования клеток в образцах костного мозга.

Благодаря химическим свойствам этой комбинации красителей можно легко распознать клеточные структуры и различить различные типы присутствующих клеток.

Насморк

Этот метод очень полезен для выявления клеток выделений из носа (эпителиальные клетки, сегментированные эозинофилы, полиморфно-ядерные клетки) при диагностике аллергического ринита.

паразитология

В этом смысле он был полезен для изучения Leishmania sp в гистиоцитах подкожной клетчатки при кожных язвах. Точно так же он используется для определения лейкоцитов в образцах стула (лейкограмма кала).

В этом случае врачу интересно знать, является ли лейкоцитоз в стуле полиморфноядерным или мононуклеарным. Этот результат лейкограммы кала поможет определить, бактериальная это инфекция или вирусная соответственно.

С другой стороны, циркулирующие в крови паразиты могут быть обнаружены в эритроцитах или свободно в плазме. Искомые паразиты - это Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii и filariae, и в ветеринарии он полезен для поиска Theileria equi и Babesia caballi, возбудителей бебиоза, особенно у лошадей.

Окраска Райта, а также окраска Гимзы позволяют отличить гемопаразитов от нормальных клеточных компонентов. Для этого можно использовать два типа спредов:

Распределить тонкий

Кровь растекается тонкой пленкой на предметном стекле. Он окрашен красителем Райта, выявляя характеристики ядра и цитоплазмы.

Толстая капля

Эта методика используется для исследования наличия паразитов в большом количестве крови.

Для этого на предметное стекло помещается большая капля крови. Оказавшись там, его необходимо дефибриллировать, делая все большие и большие круги от центра кнаружи, используя край другого предметного стекла.

Наконец, чтобы увидеть паразитов в толстом мазке, эритроциты необходимо лизировать водой.

Респираторные инфекции

На респираторном уровне этот метод также полезен, потому что клетки, присутствующие в образцах мокроты, бронхиального лаважа или бронхоальвеолярного лаважа, важны для установления диагноза.

Аналогичным образом здесь можно выделить полиморфно-ядерные клетки и мононуклеарные клетки.

бактериология

Использование этого метода в бактериологии ограничено, поскольку он не подходит для окрашивания бактерий, поэтому для их окрашивания используются другие специализированные методы окрашивания.

Тем не менее, его использовали для поиска эпителиальных клеток с включениями Chlamydia trachomatis в мазках слизистой оболочки уретры или эндоцервикального канала, хотя следует признать, что это не лучший метод для этого.

Также можно наблюдать спиралевидные бактерии, такие как Borrelia burgdorferi, среди красных кровяных телец у инфицированных пациентов, а также морулы или тельца включения Ehrlichia sp в цитоплазме лимфоцитов, моноцитов или нейтрофилов в мазке крови.

микология

Histoplasma capsulatum - патогенный гриб, часто диагностируемый при микроскопическом исследовании различных образцов тканей, окрашенных красителем Райта.

Как наблюдаются структуры образца крови с пятном Райта?

Источник: Retamales E, Mazo V. Институт общественного здравоохранения, правительство Чили. Рекомендации по окрашиванию мазков крови для чтения гемограммы.

Рекомендации по хорошему окрашиванию

Предметные стекла для образцов крови должны самопроизвольно высохнуть на воздухе. Мазки должны быть как можно более тонкими, чтобы лучше зафиксировать краситель и избежать чрезмерного окрашивания.

Для качественного окрашивания желательно окрашивать в течение двух часов после приготовления мазка. С другой стороны, идеальный образец - это капиллярная кровь без антикоагулянта.

Однако, если используется венозная кровь, ее следует использовать в качестве антикоагулянта EDTA, а не гепарина, поскольку последний может деформировать клеточные структуры.

Во избежание порчи приготовленного красителя его следует хранить в сухих местах.

В процессе стирки рекомендуется использовать воду с нейтральным pH.

Наконец, рекомендуется время от времени тестировать методы окрашивания, используемые в лаборатории.

Это делается путем окрашивания образцов или расширенных рисунков в качестве контроля качества. Этот шаг важен, так как он обеспечивает правильную подготовку окрашивания и стандартизацию времени окрашивания.

Если выкройка плохо окрашена, значит, есть проблемы, которые необходимо решить.

Распространенные ошибки при окрашивании по Райту

Очень бледное окрашивание

Очень бледные мазки обычно возникают из-за очень короткого времени окрашивания или чрезмерного промывания. Это исправляется увеличением времени контакта с красителем или уменьшением времени стирки.

Краситель осаждается

Наличие осадка красителя в мазке может быть вызвано несколькими причинами, однако наиболее частыми причинами являются: использование нефильтрованного красителя, окрашивание на неровных мостах окрашивания, использование листов, загрязненных пылью или жиром, плохая стирка полное окрашивание.

Очень красный или синий мазок

Буфер отвечает за pH красителя. Красители с pH ниже указанного (кислые) приводят к очень красноватым мазкам.

Если pH красителя выше (щелочной), получится очень синеватый мазок.

Режим хранения

Реагент следует хранить при комнатной температуре.

Ссылки

1. Гутьеррес В. Сравнительное исследование между методом окрашивания Райта и тестом Элизы для диагностики собачьего эрлихиоза в городе Сан-Педро-Сула, Гондурас. 2008. Диссертация на получение степени ветеринарного врача. Университет Сан-Карлос в Гватемале.
2. Лопес-Хакоме Л., Эрнандес-Дуран М., Колин-Кастро С., Ортега-Пенья С., Серон-Гонсалес Г., Франко-Сендехас Ф. Основные красители в микробиологической лаборатории. Исследования в области инвалидности. 2014; 3 (1): 10-18.
3. «Пятно Райта». Википедия, свободная энциклопедия. 18 мая 2018, 12:05 UTC. 8 декабря 2018, 20:37
4. Кальдерон А., Кардона Дж., Вергара Ó. Встречаемость Babesia spp. по охоте на лошадей, Кордова (Колумбия). Преподобный udcaactual divulg cient. 2013; 16 (2): 451-458.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Микробиологический диагноз Бейли и Скотта. 12 изд. Аргентина. Редакция Panamericana SA
6. Ретамалес Э., Мазо В. Институт общественного здравоохранения Чили. Рекомендации по окрашиванию мазков крови для чтения гемограммы.