РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК: ТЕХНИКА, ПРИЛОЖЕНИЯ И ОСНОВЫ - БИОЛОГИЯ - 2024

Рекомбинантной ДНК (рДНК или рДНК) представляет собой искусственный молекулу нуклеиновой кислоты , созданной в лаборатории, за счет интеграции двух сегментов процентных организаций. Она также известна как химерная ДНК благодаря своим гибридным свойствам. Этот тип ДНК не встречается в природе.

Основная методология его создания включает: (а) выбор целевой ДНК и ее вставку в другой фрагмент ДНК (обычно в бактериальную плазмиду); (б) введение этой плазмиды в бактерию, (в) отбор бактерий с помощью антибиотиков и, наконец, (г) экспрессия гена.

Источник: pixabay.com

В методике используется набор ферментов, которые позволяют копировать и вставлять определенные фрагменты ДНК в соответствии с оценкой исследователя.

Целью рекомбинантной технологии в большинстве случаев является экспрессия белка (известного как рекомбинантный белок), желаемого молекулярным биологом для будущих исследований или для создания белка, имеющего коммерческую и терапевтическую ценность, такого как человеческий инсулин, например.

Основы техники рекомбинантной ДНК и ее использование в генной инженерии

Центральная догма молекулярной биологии

Все известные нам органические существа имеют несколько общих характеристик. Один из них - природа генетического материала и способ образования белков - процесс, известный как центральная «догма» молекулярной биологии.

За исключением пары вирусов, все организмы хранят генетическую информацию в ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), очень компактно и организованно собранной в ядре клетки.

Для экспрессии генов молекула ДНК транскрибируется в информационную РНК, а последняя переводится на язык аминокислот, строительных блоков белков.

Что такое рекомбинантная ДНК?

В период с 1970-х по 1980-е годы молекулярные биологи начали использовать процессы, которые естественным образом происходят внутри клетки, и смогли экстраполировать их в лабораторию.

Таким образом, ген животного происхождения (например, позвоночного) может быть вставлен в сегмент ДНК бактерии; или ДНК бактерии может быть объединена с вирусной ДНК. Таким образом, мы можем определить рекомбинантную ДНК как молекулу, состоящую из ДНК двух разных организмов.

После создания этой гибридной или рекомбинантной молекулы интересующий ген экспрессируется. Под словом «выражение» мы подразумеваем процесс преобразования в белок.

Рестрикционные ферменты и лигазы: ключ к процессу

Ключевым элементом в разработке технологии рекомбинантной ДНК было открытие рестрикционных ферментов.

Это белковые молекулы, которые проявляют способность расщеплять ДНК (нуклеазы) на определенные последовательности, выступая в роли «молекулярных ножниц». Фрагменты, генерируемые этими ферментами, называются рестрикционными фрагментами.

Указанные ферменты могут производить симметричные разрезы в целевой последовательности (в обеих цепях на одинаковой высоте) или асимметричные разрезы. Ключевым аспектом действия рестрикционных ферментов является то, что после расщепления цепей получается «свободный край», дополняющий другой край, разрезанный тем же ферментом.

Некоторыми примерами являются ECOR 1 и Sma 1. В настоящее время известно и коммерчески доступно более 200 типов рестрикционных ферментов.

Чтобы ножницы были полезными, они должны сопровождаться клеем. Это уплотняющее действие ДНК (предварительно обработанной рестрикционными ферментами) осуществляется лигазами.

Методика: как искусственно модифицируется ДНК организма в лаборатории?

Ниже мы опишем основные шаги, которые требуются технологии рекомбинантной ДНК. Все они выполняются профессионалами в лаборатории молекулярной биологии.

Что такое «клон»?

Прежде чем продолжить экспериментальный протокол, мы должны отметить, что в молекулярной биологии и биотехнологии широко используются термин «клон» и глагол «клон». Это могло привести к путанице.

В этом контексте мы говорим не о клонировании целого организма (как, например, в случае со знаменитой овечкой Долли), а о клонировании фрагмента ДНК, который может быть геном. То есть создание множества копий - генетически идентичных - последовательности.

1. Выделение и получение ДНК

Первый шаг - решить, какую последовательность вы хотите использовать. Это полностью зависит от исследователя и целей его работы. Затем эту ДНК необходимо выделить и очистить. Методы и процедуры для достижения этого, в свою очередь, зависят от тела и тканей.

Обычно берут часть ткани и обрабатывают в буфере для лизиса протеиназой К (протеолитический фермент), а затем экстрагируют ДНК. Впоследствии генетический материал фрагментируется на небольшие фрагменты.

2. Клонирование вектора

После подготовительных шагов исследователь пытается ввести интересующий сегмент ДНК в вектор клонирования. С этого момента мы будем называть этот сегмент ДНК белой ДНК.

Плазмиды

Один из наиболее часто используемых векторов в плазмиде бактериального происхождения. Плазмида - это двухцепочечная кольцевая молекула ДНК, которая в природе встречается у бактерий. Они чужды бактериальной хромосоме, то есть внехромосомные и естественным образом обнаруживаются в этих прокариотах.

Основными элементами вектора являются: (а) точка начала репликации, которая позволяет синтез ДНК; (b) агент отбора, который позволяет идентифицировать организмы, несущие плазмиду с целевой ДНК, например устойчивость к какому-либо антибиотику; и (c) сайт мультиклонирования, где находятся последовательности, которые будут распознаваться рестрикционными ферментами.

Первую успешную рекомбинантную ДНК в лаборатории клонировали в плазмиду pSC101 из бактерии E. coli. Он содержит сайт рестрикции для рестрикционного фермента EcoRI и ген устойчивости к антибиотику в дополнение к ориджину репликации.

Встраивание целевой ДНК в плазмиду осуществляется с использованием молекулярных инструментов рестрикционных ферментов и лигаз, описанных в предыдущем разделе.

Остальные векторные типы

Помимо плазмид, ДНК может быть вставлена ​​в другой вектор, такой как лямбда бактериофага, космиды, YAC (искусственные хромосомы дрожжей), BAC (бактериальные искусственные хромосомы) и фагемиды.

3. Введение рекомбинантной ДНК.

После получения рекомбинантной молекулы ДНК (представляющего интерес гена в плазмиде или другом векторе) ее вводят в организм-хозяин или организм-хозяин, которым может быть бактерия.

Чтобы ввести чужеродную ДНК в бактерию, используется метод, называемый бактериальной трансформацией, когда организм подвергается обработке двухвалентными катионами, что делает его восприимчивым к поглощению ДНК.

Методологически мы не можем гарантировать, что 100% бактерий в нашей культуре эффективно поглотили нашу рекомбинантную молекулу ДНК. Именно здесь вступает в игру часть плазмиды, которая обладает устойчивостью к антибиотикам.

Таким образом, бактерии, захватившие плазмиду, будут устойчивы к определенному антибиотику. Для их отбора достаточно применить указанный антибиотик и забрать выживших.

4. Соберите белок.

После отбора бактерий с помощью нашей рекомбинантной ДНК мы переходим к использованию ферментативного механизма хозяина для создания интересующего белкового продукта. По мере размножения бактерий плазмида передается их потомству, поэтому она не теряется при делении.

Эта процедура использует бактерии как своего рода «фабрику» белков. Позже мы увидим, что это очень важная процедура для разработки эффективных медицинских методов лечения.

Когда культура готова и бактерии продуцируют большое количество белка, клетка лизируется или разрушается. Существует широкий спектр биохимических методов, которые позволяют очищать белки в соответствии с их физико-химическими характеристиками.

В другом экспериментальном контексте нас может не интересовать получение белка, а скорее получение последовательности ДНК как таковой. Если бы это было так, плазмиду можно было бы использовать для создания множества копий интересующего фрагмента, чтобы иметь достаточное количество целевой ДНК для проведения соответствующих экспериментов.

Приложения

Технология рекомбинантной ДНК открыла бесконечное количество возможностей в молекулярной биологии, биотехнологии, медицине и других смежных областях. Его наиболее выдающиеся применения следующие.

Генетический анализ

Первое приложение напрямую связано с лабораториями молекулярной биологии. Технология рекомбинантной ДНК позволяет исследователям понять нормальную функцию генов, а сгенерированные белки можно использовать в дальнейших исследованиях.

Фармацевтическая индустрия

Белки, полученные с использованием процедуры рекомбинантной ДНК, находят применение в медицине. Двумя очень важными примерами в этой области являются человеческий инсулин и гормон роста, которые применяются у пациентов, у которых отсутствует этот белок.

Благодаря рекомбинантной ДНК эти белки могут быть получены без необходимости извлекать их из другого человека, что представляет дополнительные методологические сложности и риски для здоровья. Это помогло улучшить качество жизни бесчисленного количества пациентов.

Ссылки

1. Бака, LEL, и Альварес, CLC (2015). Биология 2. Grupo Editor Patria.
2. Купер, Г. М., Хаусман, Р. Е., и Хаусман, Р. Е. (2000). Клетка: молекулярный подход (Том 10). Вашингтон, округ Колумбия: Пресса ASM.
3. Девлин, Т.М. (2004). Биохимия: учебник с клиническими приложениями. Я поменял направление.
4. Хан, С., Уллах, М.В., Сиддик, Р., Наби, Г., Манан, С., Юсуф, М., и Хоу, Х. (2016). Роль технологии рекомбинантной ДНК в улучшении жизни. Международный журнал геномики, 2016, 2405954.
5. Миндан, Ф. П., и Миндан, П. (1996). Патологическая анатомия. Эльзевьер Испания.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, и Case, CL (2007). Введение в микробиологию. Panamerican Medical Ed.
7. The, MJ (1989). Человеческий инсулин: первый препарат ДНК-технологии. Американский журнал фармации системы здравоохранения, 46 (11_suppl), S9-S11.