ТЕСТ ФОГЕСА-ПРОСКАУЭРА: ОСНОВА, ПОДГОТОВКА И ПРИМЕНЕНИЕ - БИОЛОГИЯ - 2025

Тест Фогеса-Проскауэра - это биохимический тест, который помогает идентифицировать бактерии, принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae. Это особенно полезно для дифференциации штаммов Escherichia coli от Klebsiella и Enterobacter, среди прочих.

Тест проводится в жидкой культуральной среде под названием Methyl Red - Voges Proskauer, более известной под аббревиатурой RM / VP. Эта среда состоит из забуференного полипептона, глюкозы, дикалийфосфата и дистиллированной воды.

Коммерческая среда Methyl Red-Voges Proskauer (RM / VP) / тест VP положительный и отрицательный соответственно. Источник: Фотография автора MSc. Мариельса Гил / Sudipta.nov15, из Wikimedia Commons

Текущая среда RM / VP представляет собой модификацию среды Кларка и Лубса, которая изначально содержала более низкую концентрацию пептонов и глюкозы. Таким образом, образуется меньше иона водорода, необходимого для положительной реакции Фогеса-Проскауэра.

Тест основан на способности микроорганизма использовать глюкозу по пути бутиленгликоля и образовывать нейтральный конечный продукт, называемый ацетоином, в присутствии кислорода и щелочного pH.

В среде RM / VP, помимо возможности выявления теста Фогеса-Проскауэра, также может быть обнаружен тест с метиловым красным.

основа

Основа теста Фогеса-Проскауэра

Присутствующие в среде плюрипептоны обеспечивают необходимые питательные вещества для роста бактерий. Со своей стороны, глюкоза является основным соединением. Многие бактерии обладают способностью метаболизировать глюкозу и образовывать пировиноградную кислоту.

Пировиноградная кислота является средней точкой метаболизма глюкозы, и оттуда каждый микроорганизм может идти разными путями. Некоторые образуют смешанные кислоты, такие как молочная кислота, уксусная кислота, муравьиная кислота и янтарная кислота, а другие образуют нейтральные продукты, такие как 2,3-бутандиол.

Тест Фогеса-Проскауэра показывает способность микроорганизма образовывать ацетилметилкарбинол (ацетоин), промежуточный продукт 2,3-бутандиола в аэробных условиях.

Ацетоин восстанавливается и образует 2,3-бутандиол, но эта реакция обратима, поэтому, если 2,3-бутандиол окисляется, образуется ацетоин. Следовательно, кислород необходим.

Фосфат калия является буфером, который буферизует смесь при pH 6,9 ± 0,2.

Основание для раскрытия и интерпретации доказательств

Чтобы продемонстрировать реакцию, необходимо провести проявку с использованием двух реагентов (реагентов Barrit), известных как Voges A и Voges B.

Voges A представляет собой 5% раствор α-нафтола, а Voges B представляет собой 40% раствор гидроксида калия. Если гидроксид калия недоступен, его можно заменить 40% гидроксидом натрия.

Α-Нафтол - катализатор, который увеличивает интенсивность окраски реакции, делая тест более чувствительным. Альфа-нафтол всегда следует добавлять первым, встряхивая трубку, чтобы среда вступила в контакт с кислородом. Таким образом, присутствующий ацетоин окисляется до диацетила, а 2,3-бутандиол окисляется с образованием ацетоина, передавая его в диацетил.

Таким образом α-нафтол будет связываться с диацетилом, который, в свою очередь, присоединился к гуанидиновому ядру, присутствующему в аминокислоте аргинине, причем последний происходит из плюрипептонов.

Со своей стороны, гидроксид калия или натрия отвечает за абсорбцию CO ₂ и реакцию с пептонами. Эта реакция вызывает образование лососево-розового цвета, отчетливо видимого после хорошего встряхивания пробирки.

Необходимо смешать правильные количества диацетила, пептона и α-нафтола, чтобы цвет появился мгновенно. Если этого не произошло, перед интерпретацией дайте трубке отдохнуть в течение 15 минут.

Обычно тест дает положительный результат через 2–5 минут, когда можно увидеть слабый розовый цвет. Если оставить от 30 мин до 1 часа, интенсивность цвета будет максимальной (интенсивный красный).

Отрицательный результат покажет, когда бульон станет желтым. Через 1 час, если тест отрицательный, может образоваться медный цвет в результате реакции гидроксида калия на α-нафтол.

подготовка

Средний MR / VP

Взвешивают 17 г обезвоженной питательной среды и растворяют в литре дистиллированной воды. Дать постоять 5 минут. Нагрейте до кипения, чтобы полностью раствориться. Разлейте по 3–4 мл в пробирки и стерилизуйте в автоклаве при 121 ° C в течение 15 минут.

Дегидратированная питательная среда имеет бежевый цвет, а приготовленная среда - светло-янтарный цвет.

Конечный pH среды составляет 6,9 ± 0,2.

Реагент Voges A

Взвешивают 5 г α-нафтола и растворяют в 50 мл этилового спирта (абсолютного). Затем продолжайте добавлять этиловый спирт до 100 мл.

Реагент Voges B

Взвесьте 40 г гидроксида калия и растворите в стакане 50 мл дистиллированной воды. Стакан необходимо поместить в баню с холодной водой для контроля температуры, потому что при растворении препарата температура резко повышается.

После того, как раствор остынет, его переносят в мерную колбу и доливают до 100 мл дистиллированной воды.

Методика испытания Фогеса-Проскауэра

Для проведения теста Фогеса-Проскауэра бульон RM / VP инокулируют исследуемым микроорганизмом из чистой культуры в течение 18–24 часов.

Посевной материал не должен быть очень плотным. Его инкубируют при 35–37 ° C в течение 24–48 часов, хотя иногда необходима инкубация в течение нескольких дней. Коуэн и Стил придерживаются мнения, что 5 дней - это минимальное время инкубации, необходимое для обнаружения всех положительных видов Voges-Proskauer (VP) семейства Enterobacteriaceae.

Разработка тестов

Разделите аликвоту 1 мл в пробирку и проявите следующим образом: поместите 12 капель (0,6 мл) реагента Voges A и 4 капли (0,2 мл) Voges B. Смешайте для аэрации и дайте отстояться. за 5-10 минут до устного перевода. Однако, если тест по-прежнему отрицательный, оставьте его и осмотрите трубку через 30 минут - 1 час.

Появление розовато-красного цвета свидетельствует о положительной реакции Фогеса-Проскауэра. Если среда остается желтой, реакция отрицательная.

Добавление разработчиков в указанном порядке и количестве необходимо во избежание ложноотрицательных результатов.

использование

Тест Фогеса-Проскауэра полезен для дифференциации штаммов E. coli, которые являются VP-отрицательными, из родов Klebsiella, Enterobacter, Serratia, среди прочих, которые являются VP-положительными.

Источник: Конеман Э., Аллен С., Янда В., Шрекенбергер П., Винн В. (2004). Микробиологическая диагностика. 5-е изд. Редакция Panamericana SA Аргентина.

QA

Для проверки качества приготовленной среды можно использовать контрольные штаммы, включая Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium и Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Ожидаемые результаты - положительные реакции Фогеса-Проскауэра только для K. pneumoniae и E. cloacae. Остальные дают отрицательную реакцию.

Ссылки

1. Britannia Laboratories. MR-VP Средний. 2015. Доступно на: www.britanialab.com
2. Microkit Laboratories. M-Ident Voges Proskauer. 2014. Доступно: http://www.medioscultivo.com.
3. Мак Фаддин Дж. (2003). Биохимические тесты для идентификации бактерий, имеющих клиническое значение. 3-е изд. Редакция Panamericana. Буэнос айрес. Аргентина.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Микробиологический диагноз Бейли и Скотта. 12 изд. Редакция Panamericana SA Аргентина.
5. Конеман Э, Аллен С., Джанда В., Шрекенбергер П., Винн В. (2004). Микробиологическая диагностика. 5-е изд. Редакция Panamericana SA Аргентина.