СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК: МАКСАМ-ГИЛБЕРТ, МЕТОД И ПРИМЕРЫ - БИОЛОГИЯ - 2025

Секвенирования ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) представляет собой процедуру , в молекулярной биологии лабораторий , что позволяет , чтобы знать порядок нуклеотидов в генетическом материале интерес. Кроме того, также может быть раскрыто секвенирование РНК (рибонуклеиновой кислоты).

Этот метод был незаменим для развития биологических наук. Это также применимо к другим областям знаний, таким как, например, медицинская диагностика и судебно-медицинские исследования.

Источник: pixabay.com

Ранее секвенирование цепи ДНК считалось медленным и дорогостоящим мероприятием, которое позволяло идентифицировать только несколько пар оснований в олигонуклеотидах.

Сегодня, с учетом всех достижений науки, секвенирование ДНК является рутинной операцией во многих лабораториях по всему миру благодаря вкладу почти 50-летних исследований в этой области. Что касается длины цепи, за очень короткое время можно секвенировать до миллионов пар оснований.

Для этого разработаны десятки методик, различающихся по цене и точности. В этой статье мы опишем как классические, так и современные техники, каждая из которых имеет свои преимущества и недостатки.

До сих пор методы секвенирования позволяют получить последовательность полных геномов, от небольших прокариот и дрожжей до генома человека.

Структура ДНК

Чтобы понять методы и методы, используемые для секвенирования ДНК, необходимо знать некоторые ключевые аспекты структуры и состава молекулы.

ДНК - это биомолекула, встречающаяся во всем живом, от бактерий до крупных водных животных. Органеллы, такие как митохондрии и хлоропласты, имеют внутри кольцевую молекулу ДНК. Даже у некоторых вирусов обнаруженный генетический материал - это ДНК.

Структурно ДНК представляет собой набор нуклеотидов. Каждый из них состоит из углевода, азотистого основания (A, T, C или G) и фосфатной группы. Цель секвенирования ДНК - выявить порядок, в котором четыре азотистых основания находятся в последовательности.

История

В середине 1950-х исследователи Уотсон и Крик описали структуру ДНК, используя христолографические методы. Однако ни один из этих исследователей не смог найти способ разгадать последовательность.

Несмотря на то, что были определенные предшественники, наиболее важным событием было создание метода Сенгера в 1977 году. Фредерик Сенгер, отец метода, был британским биохимиком, лауреатом двух Нобелевских премий за его огромный вклад в биологические науки.

Этот метод также известен в литературе как «терминация цепи» или дидезоксинуклеотиды. Принципы этой техники и тех, которые были разработаны на основе ее усовершенствования и нововведений, будут описаны ниже.

Метод Сенгера

Развитие метода Сэнгера стало решающим событием в молекулярной биологии. Он включает в себя основные компоненты процесса репликации ДНК, который обычно происходит в клетке, но с добавлением специального компонента: дидезоксинуклеотидов.

Основные компоненты реакции

- ДНК-полимераза: фермент ДНК-полимераза является важным элементом процесса. Эта молекула участвует в репликации цепи ДНК, и ее роль заключается в синтезе новой цепи, сопряжении трифосфатдезоксирибонуклеотидов с комплементарными.

Напомним, что в ДНК тимины (T) соединяются с аденинами (A) через две водородные связи, а цитозин (C) соединяется с гуанином (G) через три связи.

- Нуклеотиды: секвенирование по Сэнгеру включает два типа нуклеотидов: четыре 2'-дезоксинуклеотида (сокращенно dATP, dGTP, dCTP и dTTP) и четыре дидезоксинуклеотида (ddATP, ddGTP, ddCTP и ddTTP).

Хотя дидезоксинуклеотиды похожи на мономеры, которые обычно встраиваются в ДНК, в их структуре отсутствует группа -ОН. Это делает невозможным добавление к цепи нового нуклеотида.

Поэтому, когда особый нуклеотид добавляется - совершенно случайным образом - к образующейся цепи, синтез парализуется. Таким образом, в конце реакции появляются цепочки разного размера, каждая из которых останавливает реакцию в другой точке.

Экспериментально подготовлено четыре теста. Каждый из них содержит ДНК, извлеченную из интересующего биологического образца, нормальные нуклеотиды и один из четырех специальных типов нуклеотидов. Либо специальные нуклеотиды помечены каким-либо типом флуоресцентного маркера (см. Автоматическое секвенирование ниже).

Чтение результатов

Первый шаг - разделить каждую из синтезированных цепочек по размеру. Некоторые из них будут длиннее других, в зависимости от того, где были размещены специальные базы.

Существуют различные биохимические методы, которые позволяют разделить компоненты смеси, используя размер в качестве дискриминационного свойства. В методе Сэнгера разные цепи разделяют электрофорезом. В более сложных вариантах методики используется капиллярный электрофорез.

Таким образом, более длинные пряди перемещаются меньше, чем более короткие варианты. Затем эта система проходит через считыватель, который распознает маркер, включенный в каждый дидезоксинуклеотид. Таким образом можно узнать порядок следования.

Этот метод «первого поколения» способен считывать фрагменты ДНК размером не более 1 килобазы. В настоящее время метод Зангера используется в различных лабораториях, как правило, в его современных вариантах. Кроме того, он используется для подтверждения результатов, полученных с помощью самых сложных, но менее точных методов.

Автоматическая последовательность

Когда секвенирование требуется в большом масштабе, процесс ускоряется за счет автоматизации. Это разновидность метода терминации цепи Сэнгера, при котором праймеры метят флуоресцентными продуктами для их различения.

Затем продукт реакции подвергают электрофорезу - все на одной дорожке. Когда каждый фрагмент выходит из последней части геля, он быстро идентифицируется по его флуоресцентной метке с погрешностью около 1%.

Самые сложные системы содержат до 96 капиллярных трубок, управляемых компьютером, соединенным с роботом. То есть одновременно можно исследовать 96 образцов ДНК. Таким образом, процесс электрофореза и анализа результатов полностью автоматизирован.

За один день эти системы могут секвенировать до 550 000 баз. В этом процессе нет необходимости в человеческом труде, для запуска метода требуется всего около 15 минут.

Секвенирование Максама-Гилберта

В то же время, когда Сэнгер опубликовал свою работу, двум исследователям по имени Аллан Максан и Уолтер Гилберт удалось разработать другой метод получения последовательности ДНК. В то время метод приобрел популярность, но позже был вытеснен усовершенствованием метода Сангера.

В отличие от метода Сэнгера, секвенирование Максана и Гилберта (или химическое секвенирование, как его еще называют) не включает реакции гибридизации. Методология состоит из маркировки реактивными агентами на одном конце с последующим процессом очистки.

Один из отрицательных аспектов этой техники заключается в ее огромной сложности и использовании опасных для пользователя химикатов. Химические разрывы вызываются применением ДМС, муравьиной кислоты, гидразина и гидразина с солями.

Обработать

Протокол начинается с маркировки на 5'-конце цепи маркером 32 фосфора, затем происходит химическая модификация азотного основания, и оно отделяется. Наконец, происходит расщепление абазической области.

Сначала вы укорачиваете строку, которую хотите разделить на более мелкие сегменты. Этот шаг выполняется с помощью рестрикционных ферментов, которые приводят к выступающим концам.

Далее проводится реакция с щелочной фосфатазой, цель которой - отщепить фосфатную группу. Таким образом, для мечения можно использовать полинуклеотидкиназу.

Цепочка денатурирована (две нити открываются). Затем применяются химические вещества. Эти реакции расщепления осуществляются контролируемым образом, и известно, какие типы связей разрывает каждое применяемое химическое соединение.

Чтение результатов

Как и в методе Сэнгера, считывание результатов включает разделение по размеру цепей, полученных в системе электрофореза. Системы, состоящие из полиакриламида, позволяют получить очень адекватное разрешение для считывания геля.

Массовое секвенирование

Массовое секвенирование включает серию новых методов, сокращенно NGS, от английского «Next Generation Sequencing».

Методы, классифицируемые как NGS, требуют предварительного этапа амплификации ДНК (они не работают с отдельной молекулой). Кроме того, используемые платформы сильно различаются. Ниже будут описаны принципы работы наиболее популярных методов:

Пиросеквенирование

Он включает мониторинг высвобождения пирофосфата, который происходит каждый раз, когда к цепи ДНК добавляется новый нуклеотид. Система ферментов связана, так что излучение света (которое обнаруживается камерой) происходит каждый раз, когда включается новый нуклеотид.

Процесс начинается с отдельной инкубации каждого азотного основания, чтобы проверить, есть ли световое излучение. Пиросеквенирование позволяет считывать длинные цепочки, но частота обнаруженных ошибок высока.

Секвенирование синтеза

Это включает включение меченых нуклеотидов. Эти флуоресцентные компоненты добавляют, промывают и отмечают включенный нуклеотид. Затем нуклеотидная метка удаляется, и синтез цепи может продолжаться. На следующем этапе также будет включен меченый нуклеотид, и вышеупомянутые этапы будут повторены.

Недостаток этого метода возникает, когда флуоресцентные маркеры не удалены полностью. Эти выбросы создают фоновые ошибки, приводящие к значительным ошибкам.

Секвенирование лигирования

Этот метод отличается от других тем, что в нем не используется ДНК-полимераза. Вместо этого ключевым ферментом для этой методологии является лигаза. Здесь используются флуоресцентно меченые фрагменты ДНК, она связывается ферментом и обнаруживается.

Самая большая проблема с этим методом - это короткие фрагменты, которые он способен обрабатывать.

Секвенирование ионного потока

Этот метод основан на измерении иона H ^+, который высвобождается при каждом включении нового нуклеотида. Принцип очень похож на пиросеквенирование, но намного дешевле.

Примеры

Секвенирование генома человека

Секвенирование генома человека было одной из самых многообещающих задач в биологии, а также одним из самых известных соперников в истории науки. Фактически, для ученых, участвовавших в проекте, секвенирование генома стало соревнованием.

В 1990 году он начал так называемый «проект генома человека», возглавляемый известным ученым, лауреатом Нобелевской премии Джеймсом Ватсоном. Через год, в 1991 году, Вентер берет на себя задачу «победить» Ватсона и секвенировать геном перед ним. Однако в 1992 году Уотсон ушел на пенсию, и командование перешло к другому исследователю.

В 1995 году Вентер объявил о своем успехе в полном секвенировании бактериального генома методом случайного секвенирования. Точно так же команда противников объявила год спустя о секвенировании генома дрожжей.

В 2000 году учёба была прекращена. Обе компании опубликовали свои предварительные результаты по полному геному в двух самых престижных научных журналах: Nature и Science.

Однако ученые продолжали работать над улучшением предложений, и в 2006 году были завершены последовательности определенных хромосом человека.

Важность и приложения

Знание порядка расположения нуклеотидов в такой важной молекуле, как ДНК, ценно для биологов и других специалистов. Эта цепочка полинуклеотидов содержит всю информацию, необходимую для развития и поддержания всех форм жизни.

По этим причинам знание этой последовательности необходимо для биологических исследований. По сути, секвенирование позволяет измерить одно из наиболее важных свойств биологических систем и установить различия между ними.

Секвенирование широко используется систематиками и систематиками, поскольку определенные последовательности ДНК позволяют установить критерии, позволяющие сделать вывод о том, принадлежат ли два организма к одному и тому же виду, в дополнение к возможности выдвигать гипотезы о филогенетических отношениях между ними.

Кроме того, секвенирование ДНК находит применение в медицине и диагностике. Например, существуют недорогие и доступные системы, которые с помощью секвенирования позволяют оценить тенденцию к развитию определенных заболеваний (например, рака) с использованием так называемых однонуклеотидных полиморфизмов (SNP).

Расследования криминального и судебно-медицинского характера также были обогащены методами секвенирования, которые могут использоваться в качестве надежных доказательств причастности определенного лица к преступлению.

Ссылки

1. Хизер, Дж. М. и Чейн, Б. (2016). Последовательность секвенаторов: история секвенирования ДНК. Геномика, 107 (1), 1-8.
2. Кобольдт, округ Колумбия, Стейнберг, К.М., Ларсон, Д.Е., Уилсон, Р.К., и Мардис, Е.Р. (2013). Революция в области секвенирования нового поколения и ее влияние на геномику. Ячейка, 155 (1), 27-38.
3. Леви, Дж. (2010). Научное соперничество. От Галилея до проекта генома человека. Редакция Паранинфо.
4. Сэнгер, Ф., Никлен, С., и Колсон, А.Р. (1977). Секвенирование ДНК с помощью ингибиторов обрыва цепи. Известия национальной академии наук, 74 (12), 5463-5467.
5. Шустер, SC (2007). Секвенирование следующего поколения меняет сегодняшнюю биологию. Природные методы, 5 (1), 16.
6. Сюй Дж. (Ред.). (2014). Секвенирование нового поколения. Caister Academic Press.