ДАПИ (4 ', 6-ДИАМИДИНО-2-ФЕНИЛИНДОЛ): ХАРАКТЕРИСТИКА, ОБОСНОВАНИЕ, ПРИМЕНЕНИЕ - ХИМИЯ - 2026

DAPI (4», 6-диамидино-2-фенилиндол) представляет собой краситель флуоресцентным свойством служит в маркер, широко используемый в технике флуоресцентной микроскопии или поточной цитометрии, среди других. Он излучает ярко-синюю флуоресценцию, ее возбуждение происходит в диапазоне 455-461 нм (УФ-свет).

Краситель DAPI может легко проходить через клеточную мембрану мертвых клеток. Он также может окрашивать ядра живых клеток, но в этом случае концентрация этого должна быть выше.

Химическая структура флуоресцентного красителя DAPI. Источник: Изображение: Файл: DAPI.svg - это векторная версия этого файла. Его следует использовать вместо этого растрового изображения, если не ниже / Ричард Уиллер (Зефирис) Отредактированное изображение

Краситель способен проникать в клеточную ДНК, к которой он имеет особое сродство, с большой жадностью связываясь с азотистыми основаниями аденином и тимином. По этой причине он очень полезен в некоторых методах молекулярной биологии.

Это соединение принадлежит к группе индольных красителей и, как было показано, имеет большую чувствительность к ДНК, чем бромид этидия и иодид пропидия, особенно на агарозных гелях.

Этот флуоресцентный краситель имеет очень широкое применение, так как он полезен для: изучения изменений ДНК в процессе апоптоза (гибель клеток) и, следовательно, обнаружения клеток в этом процессе; для фото отпечатка ДНК (фотопечать ДНК); изучить бактериальное заражение; или визуализировать ядерную сегментацию.

Он также использовался при изучении хромосомных полос, при обнаружении ДНК Mycoplasmas sp, во взаимодействии ДНК-белок, при окрашивании и подсчете клеток с помощью иммунофлуоресценции и даже для окрашивания зрелых пыльцевых зерен.

характеристики

DAPI - это сокращение от его химического названия (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол). Его молекулярная формула - C ₁₆ H ₁₅ N _5. Он имеет молекулярную массу 350,3. Вблизи диапазона УФ-света (от 345 до 358 нм) происходит максимальное возбуждение комплекса DAPI-ДНК, в то время как максимальное излучение флуоресценции происходит между 455-461 нм.

Этот краситель представляет собой желтый порошок, но структуры, отмеченные этим флуорофором, излучают яркий синий свет.

Это соединение, растворимое в воде, однако для ускорения его растворения можно приложить немного тепла. Его можно разбавлять PBS, но не растворять в нем напрямую.

После приготовления краситель необходимо хранить в темноте, то есть в защищенном от света месте, при температуре от 2 до 8 ° C (холодильник). В этих условиях краситель стабилен более 3 недель или месяцев.

Если его защитить от света, но оставить при комнатной температуре, его стабильность упадет до 2 или 3 недель, но под воздействием прямого света ухудшение будет очень быстрым. Если вы хотите хранить намного дольше, его можно охладить до -20 ° C, распределив по аликвотам.

основа

Это окрашивание основано на создании ядерного контрастного пятна в основных методах молекулярной биологии, таких как проточная цитометрия, флуоресцентная микроскопия и окрашивание метафазных хромосом или интерфазных ядер, среди других.

Этот метод основан на большом сродстве красителя с азотистыми основаниями (аденином и тимином), содержащимися в генетическом материале (ДНК) в малой бороздке. На цитоплазматическом уровне он оставляет очень мало фона.

Когда флуоресцентный краситель связывается с участками ДНК аденина и тимина, флуоресценция значительно увеличивается (в 20 раз больше). Цвет, который он излучает, ярко-синий. Примечательно, что при связывании с парами оснований GC (гуанин-цитозин) испускание флуоресценции отсутствует.

Важно отметить, что, хотя он также имеет сродство к РНК, это не вызывает проблем, потому что наибольшая степень излучения энергии от этой молекулы происходит на другой длине волны (500 нм), в отличие от ДНК, которая делает это на 460 нм. нм. Более того, увеличение флуоресценции после связывания с РНК составляет всего 20%.

DAPI используется больше для окрашивания мертвых (фиксированных) клеток, чем живых клеток, поскольку для окрашивания последних требуется гораздо более высокая концентрация красителя, поскольку клеточная мембрана гораздо менее проницаема для DAPI, когда она живая.

Краситель DAPI можно использовать в сочетании с красными и зелеными флуорофорами для получения многоцветного эффекта.

использование

DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол) является прекрасным флуорофором и поэтому широко используется в различных методах и для различных целей. Ниже объясняется использование DAPI в основных методах.

Проточной цитометрии

Исследователи Годе, Шуман и Занте в 1978 году первыми использовали и предложили DAPI в качестве флуорофора в методике проточной цитометрии, добившись большого успеха из-за его высокой чувствительности к ДНК и высокой интенсивности флуоресцентного излучения.

Использование DAPI в этом методе позволяет изучать клеточный цикл, количественную оценку клеток и окрашивание живых и мертвых клеток.

Хотя существуют и другие красители, такие как бромид этидия, оксид Hoechst, акридиновый оранжевый и иодид пропидия, DAPI является одним из наиболее широко используемых красителей, поскольку он более фотостабилен, чем упомянутые ранее.

Для этой методики необходимо зафиксировать клетки, для этого можно использовать абсолютный этанол или 4% параформальдегид. Образец центрифугируется и супернатант удаляется, затем клетки гидратируются путем добавления 5 мл буфера PBS в течение 15 минут.

По прошествии времени приготовьте краситель DAPI с помощью буфера для окрашивания (FOXP3 от BioLegend) в концентрации 3 мкМ.

Центрифугируйте образец, слейте супернатант, а затем накройте 1 мл раствора DAPI на 15 минут при комнатной температуре.

Отнесите образец в проточный цитометр с помощью соответствующего лазера.

Проточная микрофлуориметрия

Другой метод, в котором используется DAPI, - это проточная микрофлуорометрия вместе с другим флуорофором, называемым митрамицином. Оба они полезны для индивидуального количественного определения ДНК хлоропластов, но DAPI лучше всего подходит для измерения частиц бактериофага Т4.

гибридизация

Этот метод в основном использует ДНК-зонды, меченные флуоресцентным красителем, который может быть DAPI.

Образец требует термической обработки, чтобы денатурировать двухцепочечную ДНК и преобразовать ее в две одноцепочечные цепи. Затем его гибридизуют с зондом денатурированной ДНК, меченным DAPI, который имеет интересующую последовательность.

Позже ее промывают, чтобы удалить то, что не было гибридизировано, для визуализации ДНК используют контраст. Флуоресцентный микроскоп позволяет наблюдать гибридизированный зонд.

Этот метод предназначен для обнаружения определенных последовательностей в хромосомной ДНК, что позволяет диагностировать определенные заболевания.

Эти цитомолекулярные методы очень помогли в определении деталей при изучении кариотипов. Например, он показал богатые парами оснований области аденозина и тимина, называемые гетерохроматическими областями или полосами DAPI.

Этот метод широко используется для исследования хромосом и хроматина у растений и животных, а также для диагностики пренатальных и гематологических патологий у человека.

В этом методе рекомендуемая концентрация DAPI составляет 150 нг / мл в течение 15 минут.

Собранные слайды следует хранить в защищенном от света месте при температуре 2-8 ° C.

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Клетки фиксируют 4% параформальдегидом. Если необходимо использовать другие красители, DAPI оставляют в конце в качестве контрастного красителя, и клетки покрывают раствором PBS на 15 минут. По прошествии времени приготовьте раствор DAPI, разбавив PBS, так, чтобы конечная концентрация составляла 300 мкМ.

Затем избыток PBS удаляют и покрывают DAPI на 5 минут. Стирает несколько раз. Слайд просматривают под флуоресцентным микроскопом под соответствующим фильтром.

Паспорт безопасности

С этим соединением необходимо обращаться осторожно, поскольку это соединение обладает мутагенными свойствами. Активированный уголь используется для удаления этого соединения из водных растворов, которые необходимо выбросить.

Необходимо использовать перчатки, халат и защитные очки, чтобы избежать несчастных случаев с этим реагентом. При попадании на кожу или слизистые оболочки необходимо промыть пораженный участок достаточным количеством воды.

Никогда не пипетируйте этот реагент через рот, используйте пипетки.

Не загрязняйте реагент микробными агентами, так как это приведет к ошибочным результатам.

Не разбавляйте краситель DAPI больше рекомендованного, так как это значительно ухудшит качество пятна.

Не подвергайте реагент воздействию прямого света и не храните его в тепле, поскольку это снижает флуоресценцию.

Ссылки

1. Brammer S, Toniazzo C и Poersch L. Corantes обычно участвуют в цитогенетике растений. Институт биологии, 2015, 82. Доступно по адресу: scielo.
2. Лаборатории Импат. DAPI. Доступно на: menarinidiagnostics.com/
3. Cytocell Laboratories. 2019. Инструкция по использованию DAPI. доступно на cytocell.com
4. Элосеги А., Сабатер С. Концепции и методы речной экологии. (2009). Редакция Rubes, Испания. Доступно на: books.google.co.ve/
5. Новаес Р., Пенитенте А., Талвани А., Натали А., Невес С., Мальдонадо И. Использование флуоресценции в модифицированном методе диссектора для оценки количества миоцитов в сердечной ткани. Arch. Бюстгальтеры. Cardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Доступно с: scielo.
6. Рохас-Мартинес Р., Завалета-Мехиа Е., Ривас-Валенсия П. Наличие фитоплазмы в папайе (Carica papaya) в Мексике. Журнал Чапинго. Серия «Садоводство», 2011 г .; 17 (1), 47-50. Доступно на: scielo.org.