БИУРЕТ: ОБОСНОВАНИЕ, РЕАГЕНТЫ, ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ, ПРИМЕНЕНИЕ - БИОЛОГИЯ - 2025

Биурета является реагент , используемый для определения белка с длинной цепью и короткой цепью. Он особенно используется в области аналитической химии и анализа мочи для исследования концентрации общих белков в сыворотке, плазме и моче.

При определенных патологиях содержание белка может увеличиваться или уменьшаться. Симптомы гипопротеинемии обычно возникают у пациентов с заболеванием почек, у истощенных пациентов и у пациентов с хроническими инфекциями.

Химическая структура комплекса, образующегося в реакции Биурета. Положительный биуретовый тест. Источник: Yikrazuul / flickr

В то время как гиперпротеинемия наблюдается при таких патологиях, как множественная миелома, системная красная волчанка, бактериальный эндокардит, бактериальный менингит, макроглобулинемия Вальденстрема и другие.

С другой стороны, присутствие белка в моче связано с фильтрацией альбумина почками. Это патологическое поведение, которое необходимо изучить.

В этом смысле Биурет очень полезен, поскольку он позволяет количественно определять присутствие белков в сыворотке, плазме, моче и многих других образцах.

Даже Биурет можно использовать для исследования присутствия и концентрации белков в малоизученных образцах или неизвестного состава. Поэтому он широко используется в исследовательской сфере.

Биуретовый тест основан на обнаружении пептидных связей. Испытание проводится в щелочной среде. Образец должен содержать не менее двух пептидных связей для образования фиолетово-пурпурного комплекса. Комплекс образован объединением связей и иона меди.

основа

Реагент Биурета состоит из гидроксида калия, сульфата меди и тартрата натрия и калия. Гидроксид натрия используется для подщелачивания среды, поскольку это условие необходимо для протекания реакции.

Вещество, которое вступает в реакцию с белками, представляет собой сульфат меди, а тартрат натрия имеет функцию предотвращения образования гидроксида меди, который имеет тенденцию к осаждению и мешает реакции.

Если в образце обнаружены вещества с пептидными связями (полипептиды или белки), тест будет положительным.

Когда раствор становится фиолетовым, реакция считается положительной. Окраска достигается за счет образования комплекса между по крайней мере двумя пептидными связями, которые имеют группу CO-NH и катионы двухвалентной меди.

Фиолетовый комплекс может быть образован двумя способами: первый - за счет потери протонов амидных групп, которые связываются с металлом (депронотация), а второй - за счет объединения свободных и связывающих электронов кислорода и азота. с медью.

Эта реакция может различаться по интенсивности и цвету в зависимости от типа белка.

Тест может быть выполнен качественно или количественно. В качественной форме это сообщается как положительное или отрицательное. В то время как в количественной форме концентрация может быть измерена спектрофотометрическим методом.

Реакция читается в диапазоне 540-560 нм. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации пептидных связей в образце.

Реактивы

-20% гидроксид натрия (NaOH)

-Пентагидрат сульфата кубической кислоты 1% (CuSO _4, 5H ₂ O)

-Смешанный тетрагидрат тартрата натрия и калия (KNaC ₄ H ₄ O ₆ · 4H ₂ O)

Стабильность реагентов биурета

-Он должен храниться в холодильнике.

Обработать

Техника

- Поместите 100 мкл образца или стандарта для анализа в пробирку.

-Добавьте 2 мл гидроксида натрия.

-Очень хорошо перемешать.

-Добавьте 5 мл реагента Биурета.

-Перемешать и оставить на 25 минут при комнатной температуре, накрыть крышкой и защитить от света.

-Наблюдайте за формированием цвета и измеряйте спектрофотометрически.

Калибровочная кривая

Бычий сывороточный альбумин можно использовать в качестве стандарта для построения калибровочной кривой. Из него готовят разные концентрации. Например 25, 50, 75, 100, 125 и 150%.

Устанавливают реакцию со всеми этими известными концентрациями, и оптическую плотность измеряют при длине волны 540 нм. На основе данных известных концентраций и значений оптической плотности строится калибровочная кривая.

При каждом определении или партии обработанных образцов рекомендуется устанавливать стандарт. В качестве калибровочного стандарта можно использовать бычий сывороточный альбумин 0,1–2 мг / мл.

Измерения производятся на спектрофотометре при 540 нм.

Линейность соблюдается до концентрации 12 г / дл.

интерференция

Вещества, мешающие проведению биуретовой пробы

Следует отметить, что некоторые вещества могут мешать во время выполнения этого теста, хотя это не очень часто. Например, присутствие аммиака может препятствовать образованию окраски.

Точно так же другие вещества могут поглощать на той же длине волны, например, определенные пигменты.

С другой стороны, интерференция может возникать, когда вещество, отличное от пептидной связи, образует комплекс с солью меди. Пример: некоторые углеводы и определенные липиды.

В случае, если в анализируемой пробе присутствует осадок какого-либо типа, ее необходимо отфильтровать или центрифугировать перед проведением теста.

Вещества, не влияющие на биуретовый тест

На тест не влияет наличие:

-Билирубин до концентрации 20 мг / дл.

-Гемоглобин до концентрации 750 мг / дл.

-Декстран до концентрации 30 г / л.

-Триглицериды до концентрации 4000 мг / дл.

преимущество

-Это простой метод для выполнения.

-Это экономический тест.

-Обладает высокой специфичностью к белкам.

-Маленькие помехи.

Недостатки

У него плохая чувствительность для обнаружения небольшого количества белка. Работа, проведенная Fuentes и др., Подтверждает, что метод испытания Biuret имеет предел обнаружения 1 мг / мл белка и предел количественного определения 3 мг / мл.

Однако другие исследования, проведенные в Университете Амазонии, показывают гораздо более низкие значения. Предел обнаружения, указанный в исследовании, составляет 0,020 мг / мл, а предел количественного определения - 1,33 мг / мл.

Приложения

Реагент или тест Biuret используется для определения белков в клинических и неклинических образцах в обычных и исследовательских лабораториях.

Патологии, возникающие при увеличении или уменьшении

При многих патологиях важно определить концентрацию общих белков в клинических образцах, которая может быть повышена или понижена.

Они возведены в:

-Множественная миелома,

-Системная красная волчанка,

-Бактериальный эндокардит,

-Бактериальный менингит,

Макроглобулинемия Вальденстрема и другие.

Уменьшается:

-Почечная недостаточность,

-Люди с тяжелой степенью недоедания,

- Пациенты с хроническими инфекциями, в том числе.

Клинические образцы

Наиболее распространенными клиническими образцами являются сыворотка, плазма и моча. Нормальное значение белков в сыворотке или плазме составляет 6,0-8,8 г / дл.

Концентрация белков в моче у взрослых не превышает показателя 150 мг / 24 часа.

Нормальное значение отношения протеин / креатинин мочи

Младенцы: <0,50 мг

Дети от 2 лет: индекс: 0,20 мг.

Взрослые: <0,2 мг

Доклинические образцы

Реакция Биурета может использоваться для многих типов неклинических образцов, таких как молочные продукты, противоядие или любое неизвестное вещество, на наличие белков которого вы хотите исследовать.

Ссылки

1. Васкес Дж., Герра Л., Кинтана Дж., Рамирес Дж., Фернандо Ри Васкес Й. (2014). Физико-химическая характеристика и содержание белка в жидких экстрактах мангровых устриц (Crassostrearizophorae). Кубинский химический журнал, 26 (1), 66-74. Получено 26 июня 2019 г. с http: //scielo.sld.
2. Чапарро С., Лара А., Сандовал А., Соса С., Мартинес Дж., Хиль Дж. Функциональная характеристика миндаля семян манго (Mangifera indica L.) Revista Ciencia en Desarrollo. 2015; 6 (1): 67-75
3. «Биурет.» Википедия, свободная энциклопедия. 19 июня 2019, 16:37 UTC. 26 июн 2019, 22:18
4. Fuentes F, Quispe I, García J. Стандартизация метода биурета для количественного определения общего количества белков в поливалентной антиботропной сыворотке, произведенной в Национальном центре биологических продуктов INS. Бол - Inst Nac Salud 2012; 18 (11-12). Доступно по адресу: repositorio.ins.gob.pe
5. Winer Laboratories. Всего белков. Колориметрический метод определения общих белков в сыворотке и плазме. Доступно на: wiener-lab.com.ar