Агар ТХБА является средством высокой селективности и дифференциальной твердой культуры, используемым для выделения и культивирования бактерий рода Vibrio, особенно холерного вибрион, В. parahaemolyticus и В. vulnificus в качестве основных возбудителей такого рода.
Аббревиатура TCBS расшифровывается как Thiosulfate Citrate Bile Sucrose. Этот агар также известен как селективная среда для вибрионов. Первоначальная формула была создана Наканиши, а затем модифицирована Кобаяши.
Коммерческая среда TCBS и пластина с агаром TCBS, засеянная холерным вибрионом. Источник: фото 1: взято автором MSc. Мариэлса Хил / Фото 2: Microrao, JJMMC, Давангере, Карнатака, Индия
Он состоит из дрожжевого экстракта, мясного пептона, триптеина, цитрата натрия, тиосульфата натрия, бычьей желчи, сахарозы, хлорида натрия, цитрата железа, бромтимолового синего, тимолового синего и агара.
Этот состав обеспечивает адекватное развитие видов Vibrio в образцах воды, пищи и фекалий; за исключением Vibrio hollisae, который не растет на этой среде. Кроме того, среда TCBS способна подавлять рост других сопутствующих бактерий, особенно колиформ.
В связи с серьезными желудочно-кишечными и экстракишечными проблемами, вызываемыми некоторыми видами рода Vibrio, его диагностика очень важна. Люди заражаются в основном при употреблении в пищу сырых или недостаточно приготовленных продуктов из моря или загрязненных вод, а также через раневую инфекцию.
Из-за этого клинические лаборатории должны включать агар TCBS в исследование жидких образцов стула, особенно с появлением рисовой воды. Особенно, если пациент сообщает, что контактировал с морской водой или употреблял в пищу моллюсков или рыбу.
основа
Источником питания этой среды являются дрожжевой экстракт, мясные пептоны и триптеин. Однако агар TCBS - негостеприимная среда для большинства бактерий.
Его высокая селективность обеспечивается добавлением цитрата натрия и бычьей желчи; оба являются ингибиторами, которые также обеспечивают щелочной pH среды, ограничивая рост сопутствующей флоры и способствуя росту V. cholerae, среди других видов. Следует отметить, что холерный вибрион очень чувствителен к кислотности.
Со своей стороны, хлорид натрия осмотически уравновешивает среду. Кроме того, поскольку его концентрация высока, он также действует как ингибитор, способствуя росту галофильных бактерий.
Сахароза - это ферментируемый сахар, который вместе с индикаторами pH бромтимоловым синим и тимоловым синим придает среде ее дифференциальный характер. По этой причине с помощью этой среды можно отличить штаммы, ферментирующие сахарозу, от неферментирующих.
Колонии штаммов, ферментирующих сахарозу, приобретают желтый цвет, а среда меняет цвет с зеленого на желтый из-за образования кислоты. Не ферментеры становятся полупрозрачными, а среда сохраняет исходный цвет (зеленый).
Точно так же эта среда содержит тиосульфат натрия в качестве источника серы и цитрат железа в качестве проявляющего агента. Оба показывают бактерии, способные производить сероводород (бесцветный газ). H 2 S образуется из тиосульфата, а затем при реакции с цитратом железа (III) образуется видимый черный осадок.
Наконец, твердую консистенцию среды обеспечивает агар.
подготовка
Взвешивают 89 г обезвоженной среды и растворяют в одном литре дистиллированной воды. Способствовать растворению путем нагревания и частого перемешивания. Смесь можно кипятить до 2 минут.
Этот носитель не автоклавирован. После растворения его подают прямо на стерильные тарелки. Когда они застывают, они перевернуты на тромбоцитах и хранятся в холодильнике (2-8 ° C) до использования.
После приготовления среда должна оставаться при pH 8,6 ± 0,2.
Цвет дегидратированной среды - светло-бежевый или зеленовато-бежевый, а цвет среды - лесной зеленый или голубовато-зеленый.
Перед посевом образцов важно дать планшетам прогреться.
использование
Наиболее частым образцом для выделения вибрионов является диарейный стул.
Образцы стула, если они не могут быть немедленно посеяны на селективную среду, следует транспортировать на среде Кэри Блэра.
Для повышения чувствительности культуры кал можно пропускать через пептонную воду при pH 8,4 в качестве среды обогащения в течение максимум 8 часов, после чего их пересевают в среду TCBS.
Также необходимо учитывать, что некоторые штаммы вибрионов могут вызывать сепсис у пациентов с ослабленным иммунитетом, поэтому их можно выделить из посевов крови. Точно так же образцы воды и продуктов питания из моря могут быть проанализированы во время эпидемических вспышек холеры.
Посевная
Посевной материал исследуемой пробы должен быть видным, посев проводят методом исчерпания. Планшеты инкубируют при 37 ° C в течение 24 часов в условиях аэробиоза.
Предполагаемые колонии Vibrio cholerae среднего размера, гладкие, непрозрачные, с тонкими границами и желтого цвета из-за ферментации сахарозы.
Подобным образом растут виды V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hareyi, V. cincinnatiensis, V. Furnissii, V. metschnikovii и некоторые V. vulnificus. Другие клинически важные виды Vibrios, такие как V. parahaemolyticus, не ферментируют сахарозу, развиваясь в виде колоний оливкового цвета.
Чашка с агаром TCBS, засеянная Vibrio parahaemolyticus. Источник: isis325 Flickr
С другой стороны, необходимо иметь в виду, что некоторые штаммы Aeromonas и Plesiomonas, которые являются оксидазой (+), могут расти в этой среде, образуя желтые колонии, которые могут сбить с толку врача. В то время как некоторые штаммы Pseudomonas также оксидаза (+) растут в виде зеленых колоний, таких как V. parahaemolyticus.
ограничение
Тест на оксидазу, положительный для рода Vibrio, никогда не следует проводить на колониях, полученных из агара TCBS, поскольку полученный результат будет ложноотрицательным. Соединения в середине сильно мешают этому тесту. Поэтому его нужно делать из субкультур на кровяном агаре.
контроль качества
Чтобы убедиться, что среда находится в хорошем состоянии, рекомендуется высевать известные или сертифицированные контрольные штаммы и наблюдать, соответствует ли рост ожидаемым характеристикам.
Для этого можно использовать штаммы:
-Vibrio cholerae- удовлетворительного роста (желтые колонии, полупрозрачная граница).
-Vibrio parahaemolyticus - рост удовлетворительный (колония с зеленым центром и полупрозрачной каймой).
-Vibrio alginolyticus ATCC 17749 - удовлетворительный рост (желтые колонии с ореолом такого же цвета вокруг колонии).
-Enterococcus faecalis ATCC 29212 - полное или частичное ингибирование (маленькие желтые или полупрозрачные колонии).
-Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853-– частичное или полное ингибирование (синие колонии).
-Escherichia coli ATCC 25922 - Полностью ингибируется.
-Proteus mirabilis ATCC 43071 -– Полное или частичное ингибирование. (Небольшие колонии, зеленый центр, полупрозрачная граница).
Инкубация незасеянной среды должна быть неизменной.
Ссылки
- Дифко Франсиско Сориа Мельгисо Лаборатории. Агар TCBS. 2009. Доступно на: f-soria.es
- БД Лаборатория. BD. TCBS Agar 2003. Доступно на: bd.com
- Britannia Laboratories. TCBS Средний. 2015. Доступно на: britanialab.com.
- Acumedia Laboratories. TCBS Agar. 2016 г. Доступно на: foodsafety.neogen.com
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Микробиологический диагноз Бейли и Скотта. 12 изд. Редакция Panamericana SA Аргентина.
- Конеман Э, Аллен С., Джанда В., Шрекенбергер П., Винн В. (2004). Микробиологическая диагностика. 5-е изд. Редакция Panamericana SA Аргентина.