ШАРИК СТАНДАРТНОГО АГАРА: ОСНОВА, ПОДГОТОВКА И ПРИМЕНЕНИЕ - БИОЛОГИЯ - 2025

Стандартный счетчик агар представляет собой твердый, не селективной культуральной среде, предназначенной для количественного определения аэробной микробной нагрузки настоящее время в пробах питьевой воды, сточных вод, молочных напитков, среди других пищевых продуктов. Эта среда также известна как агар PCA по аббревиатуре English Plate Count Agar. Он был создан в 1953 году Бухбиндером, Барисом и Гольдштейном.

Стандартная агаровая среда для подсчета состоит из дрожжевого экстракта, триптеина, глюкозы, агара и дистиллированной воды. Этот состав содержит основные питательные элементы, которые позволяют развить нынешнюю аэробную микробную нагрузку, не требуя больших затрат.

Десятичные разведения для подсчета КОЕ при стандартном подсчете на агар. Источник: Квентин Гейссманн

Поскольку среда не содержит ингибиторов, бактерии могут расти без каких-либо ограничений, что делает ее идеальной для общего подсчета колоний. Однако метод количественного определения бляшек не обнаружит всех присутствующих бактерий, а только тех, которые способны расти в условиях окружающей среды, в которых находится засеянный агар для стандартного подсчета.

В этом смысле метод количественного анализа на чашках обычно направлен на определение количества бактерий аэробного мезофильного типа, то есть тех, которые растут при температуре от 25 до 40 ° C, с оптимальной температурой роста 37 ° C. ,

Эта группа бактерий очень важна, потому что именно там находится большинство болезнетворных для человека бактерий.

Следует отметить, что иногда может быть интересно определить количество психрофильных бактерий, присутствующих в пище. Это те бактерии, которые растут при низких температурах (<20 ° C) и вызывают более быстрое разложение продуктов, даже когда они заморожены.

Точно так же термофильные бактерии, которые развиваются в диапазоне от 50 ° C до 80 ° C или более, могут иметь важное значение в определенных типах пищевых продуктов, таких как консервы.

Количественное определение микробов выражается в колониеобразующих единицах (КОЕ) на грамм или миллилитр образца.

основа

Стандартная среда для подсчета предназначена для успешного роста неприхотливых аэробных бактерий, поскольку дрожжевой экстракт, триптеин и глюкоза обеспечивают необходимые питательные вещества для хорошего роста микробов.

С другой стороны, среда имеет светлый цвет и прозрачный вид, поэтому она идеальна для визуализации колоний, полученных методом глубокого посева (заливка чашек).

Возможен также подсчет колоний методом поверхностного посева шпателем Дригальского.

Если микробная нагрузка высока, необходимо выполнить десятичные разведения исследуемого образца, чтобы можно было подсчитать КОЕ.

Следует отметить, что эта среда рекомендована Американской ассоциацией общественного здравоохранения (APHA) для подсчета аэробных мезофилов.

подготовка

Взвешивают 23,5 г обезвоженной среды и растворяют в литре дистиллированной воды. Чтобы смесь полностью растворилась, ее следует нагреть, часто помешивая, до кипения. Последующие шаги зависят от используемой техники посева.

Для техники заливки пластиной

Разлить по 12-15 мл в пробирки. Затем стерилизуйте в автоклаве при 121 ° C в течение 15 минут. Дать застыть вертикально в форме блока. Хранить в холодильнике до использования.

Расплавьте свечу, когда собираетесь ее использовать. После расплавления храните его на водяной бане при температуре 44–47 ° C, пока образцы готовятся.

Для поверхностного посева

Стерилизовать среду в автоклаве при 121 ° C, а затем разлить по 20 мл в стерильные чашки Петри. Дать застыть, перевернуть и хранить в холодильнике до использования.

Перед использованием закаливайте пластины. PH среды должен составлять 7,0 ± 0,2.

использование

Агар Standard Count Agar используется в технике аэробного мезофильного подсчета во время микробиологического анализа воды и пищевых продуктов. Подсчет аэробных мезофилов необходим, поскольку он определяет санитарное качество исследуемой пробы.

Применение этого метода (с использованием этой среды) позволяет макроскопически визуализировать изолированные колонии для их количественного определения.

Техника заливки пластин (глубинный задел)

-Обработать

Методика состоит из следующего:

1) Гомогенизируйте образец, чтобы перераспределить присутствующие бактерии.

2) Первоначальную суспензию готовят в стерильном флаконе или пакете, соблюдая соотношение 10 г или 10 мл образца в 90 мл разбавителя (10 ^-1 ).

3) Из исходной суспензии делаются соответствующие десятичные разведения в зависимости от типа образца. Пример: ( ^10-2 , ^10-3 , ^10-4 ). Разведения производятся пептонной водой или фосфатным буфером.

Для этого возьмите 1 мл исходной суспензии и поместите ее в 9 мл разбавителя, при необходимости продолжите разведения, взяв 1 мл разведения ^10-2 и так далее.

4) Возьмите по 1 мл каждого разведения и поместите в пустые стерильные чашки Петри.

5) Добавьте в каждую чашку от 12 до 15 мл агара для стандартных подсчетов, предварительно расплавленного и отстоявшегося при 44-47 ° C.

6) Осторожно поверните чашки, чтобы равномерно распределить образец по агару и дать ему затвердеть.

7) Переверните чашки и инкубируйте при 37 ° C в условиях аэробиоза от 24 до 48 часов.

8) По окончании времени чашки исследуют и подсчитывают количество колоний в том разведении, которое позволяет это. Для подсчета выбираются те чашки, в которых содержится от 30 до 300 КОЕ.

Подсчет можно производить вручную или использовать оборудование для подсчета колоний.

Допустимые значения на мл образца могут отличаться от страны к стране в зависимости от нормативных требований, которыми они регулируются.

-Расчет UFC

Общий расчет производится по следующей формуле:

Формула для общего расчета количественного определения КОЕ. Источник: Национальное управление лекарственных средств, пищевых продуктов и медицинских технологий (ANMAT). Микробиологический анализ пищевых продуктов, официальная аналитическая методика, индикаторные микроорганизмы. 2014 Том 3. Доступно на: anmat.gov.ar

Выразите результат 1 или 2 цифрами, умножив на соответствующую базу 10. Пример: если результат 16 545, он округляется с учетом третьей цифры до 17 000 и будет выражен следующим образом: 1,7 x 10 ⁴ . Теперь, если результат был 16 436, округлим его до 16 000 и выразили 1,6 x 10 ⁴ .

Техника поверхностного посева

-Обработать

- Засеять 0,1 мл прямого образца, если он жидкий, исходной суспензии 10 ^-1 или последовательных разведений 10 ^-2 , 10 ^{-3 и} т. Д. В центре чашки с агаром для стандартного подсчета.

- Равномерно распределите образец шпателем Дригальского или стеклянной палочкой L-образной формы и дайте ему постоять 10 минут.

-Переверните чашки и инкубируйте в аэробных условиях при 37 ° C в течение 24–48 часов.

-Продолжайте подсчет колоний, выберите те чашки, которые находятся в диапазоне от 20 до 250 КОЕ.

-Расчет UFC

Для расчета применяется коэффициент разбавления, который является обратным. Число округляется до 2 значащих цифр (округление в соответствии с третьей цифрой) и выражается в степени по основанию 10. Например, если в образце подсчитано 224 КОЕ без разбавления (10 ^-1 ), сообщается 22 x 10 ¹ КОЕ. , но если бы этот показатель был 225, сообщается 23 x 10 ¹ КОЕ.

Теперь, если подсчитать 199 КОЕ в разведении 10 ^-3 , будет сообщено 20 x 10 ⁴ КОЕ, но если 153 КОЕ подсчитано в том же разведении, будет сообщено 15 x 10 ⁴ КОЕ.

контроль качества

Стандартная культуральная среда для подсчета может быть оценена с использованием известных сертифицированных штаммов, таких как: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Если питательная среда находится в оптимальных условиях, во всех случаях ожидается удовлетворительный рост, за исключением L. fermentum, урожайность которого может быть регулярной.

Чтобы оценить стерильность культуральной среды, одну или две чашки каждой приготовленной партии (без инокуляции) следует инкубировать при 37 ° C в аэробиозе в течение 24 часов. По истечении этого времени в среде не должно наблюдаться роста или изменения цвета.

Ограничения

-Не растапливайте агар более одного раза.

-Приготовленная среда может храниться до 3 месяцев при хранении в холодильнике в защищенном от света месте.

-Эта среда не подходит для требовательных или анаэробных микроорганизмов.

Ссылки

1. Национальное управление лекарств, пищевых продуктов и медицинских технологий (ANMAT). Микробиологический анализ пищевых продуктов, официальная аналитическая методика, индикаторные микроорганизмы. 2014 Том 3. Доступно на: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, SA Plate Count Agar. 2009 г. Доступно на: http://f-soria.es
3. Conda Pronadisa Laboratories. Стандартный метод агара (PCA) в соответствии с APHA и ISO 4833. Доступно на: condalab.com
4. Britannia Laboratories. Подсчет на чашках с агаром. 2015. Доступно на: britanialab.com.
5. Камачо А., Джайлс М., Ортегон А., Палао М., Серрано Б. и Веласкес О. 2009. Методы микробиологического анализа пищевых продуктов. 2-е изд. Химический факультет УНАМ. Мексика. Доступно на: depa.fquim.unam