ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ: ОБОСНОВАНИЕ, ПРОТОКОЛ И ПРИМЕНЕНИЕ - БИОЛОГИЯ - 2025

Иммунофлюоресценции являются мощным средством иммунного окрашивания с использованием антител , ковалентно связанных с флуоресцентными молекулами , чтобы идентифицировать конкретные цели в образцах клеток , фиксированных на твердую подложку.

Этот метод включает микроскопическое наблюдение с иммунологической специфичностью, что позволяет наблюдать живые или мертвые клетки, которые могут представлять крошечные количества антигенов. Он широко используется как в области исследований, так и при клинической диагностике различных патологий.

Иммуномечение актиновых филаментов в клетках кардиомиоцитов (Источник: Ps1415 через Wikimedia Commons)

Этот метод, в основном качественный (с некоторыми количественными вариантами), связан конкретно с визуализацией образца по сигналу продукта флуорофора, который представляет собой флуоресцентную молекулу, связанную с антителом и способную возбуждаться на определенной длине волны. ,

В клеточном контексте очень полезно изучать наличие / отсутствие и субклеточное расположение белков. Первоначально этот метод использовался в клинических условиях для диагностики вирусов, таких как грипп, а затем и многих других инфекционных заболеваний.

Это высокочувствительный метод, и при наличии соответствующего микроскопического оборудования он может иметь очень хорошее разрешение. Для его наблюдения необходимо использовать конфокальный или эпифлуоресцентный микроскоп.

Однако, несмотря на то, что он очень популярен, он может представлять некоторые важные проблемы в отношении получения неспецифической флуоресценции, которая генерирует некоторый фоновый «шум», который часто ограничивает адекватное считывание результатов.

основа

Иммунофлуоресценция основана на использовании биологического феномена реакции взаимодействия между антителом и антигеном. Это связано с визуализацией или обнаружением этой реакции путем возбуждения флуоресцентных молекул до определенной длины волны.

Антитело - это белок иммуноглобулина, секретируемый активными В-клетками, который специфически генерируется против антигена, с которым оно может связываться с большим сродством и специфичностью. Иммунофлуоресценция использует иммуноглобулины IgG, которые растворимы в сыворотке крови.

Антитела представляют собой молекулы до 950 кДа, состоящие из двух коротких (легкая) и двух длинных Y-образных (тяжелых) пептидных цепей. И легкая, и тяжелая цепи разделены на два домена: один вариабельный, способный распознавать антиген, и другой постоянный или консервативный, характерный для каждого вида.

Антигены функционально определяются как молекулы, которые могут распознаваться антителом и по большей части являются белками. Когда животное подвергается воздействию антигена, лимфоциты иммунной системы активируются, вырабатывая против него специфические антитела, которые действуют как защитная система.

Антиген, такой как белок, например, может иметь более одного эпитопа или сайта распознавания антителом, таким образом, сыворотка животного, подвергшегося воздействию антигена, может содержать поликлональные антитела против различных участков одного и того же белка.

Таким образом, иммунофлуоресценция использует способность животного вырабатывать поликлональные антитела против определенного антигена, чтобы очистить его и впоследствии использовать для обнаружения того же антигена в других контекстах.

Среди флуоресцентных красителей или молекул, наиболее используемых для некоторых методов иммунофлуоресценции, есть флуоресцеинизотиоцианат (FITC), тетраметилродамина изотиоцианат-5 и 6 (TRITC), многие цианины, такие как Cy2, Cy3, Cy5 и Cy7, и красители, называемые Alexa Fluor®. , например Alexa Fluor®448.

протокол

Протокол иммунофлуоресценции варьируется в зависимости от многих факторов, однако, в общих чертах, он включает линейную последовательность шагов, состоящую из:

• Подготовка планшетов и ячеек
• Фиксация образцов
• пермеабилизирующего
• блокировка
• Иммуноокрашивание или иммуноокрашивание
• Сборка и наблюдение

-Подготовка

Образцов

Подготовка образцов будет зависеть от их характера и типа опыта, который необходимо провести. Ниже будет объяснен простейший случай, когда используются клетки в суспензии.

Клетки в суспензии, то есть в жидкой культуральной среде, необходимо сначала отделить от нее центрифугированием, а затем промыть буферным раствором или изосмотическим «буфером», который сохраняет их целостность.

Обычно используется фосфатно-солевой буфер, известный как PBS, в котором клетки ресуспендируют, и эту смесь снова центрифугируют для получения клеток, свободных от культуральной среды, которая может содержать мешающие вещества.

Лезвий

Предметные стекла, используемые для микроскопических наблюдений, на которых впоследствии будут фиксироваться клетки для соответствующих последующих обработок, также должны быть тщательно подготовлены.

Они покрыты или «сенсибилизированы» раствором полилизина, синтетического полимера, который будет действовать как «молекулярный клей» между клетками и твердой подложкой благодаря электростатическому взаимодействию между положительными зарядами их аминогрупп и отрицательные заряды на белках, покрывающих клетки.

Фиксация образцов

Этот процесс заключается в иммобилизации белков, обнаруженных внутри клетки, с целью сохранения их пространственного положения нетронутым. Используемые молекулы должны быть способны пересекать все типы клеточных мембран и образовывать решетки с ковалентными белками.

Широко используются формальдегид и параформальдегид, глутаральдегид и даже метанол, с которыми образцы клеток инкубируют в течение определенного времени, а затем промывают изосмотическим буферным раствором.

После фиксации клеток они продолжают прикрепляться к листам, ранее сенсибилизированным полилизином.

пермеабилизирующего

В зависимости от типа проведенного теста необходимо будет или нет проницаемость исследуемых клеток. Если требуется узнать местонахождение, присутствие или отсутствие определенного белка на поверхности клетки, в пермеабилизации нет необходимости.

С другой стороны, если вы хотите узнать местонахождение белка внутри клетки, необходима пермеабилизация, которая будет заключаться в инкубации образцов с Triton X-100, детергентом, способным повышать проницаемость клеточных мембран.

блокировка

Фундаментальный шаг во всех иммунологических методах - блокирование. На этом этапе процедуры блокирование заключается в закрытии сенсибилизированных пластинок всех участков молекулами полилизина, к которым клетки не прикрепились. То есть предотвращает неспецифический союз.

Обычно для блокирования используются растворы с бычьим сывороточным альбумином (BSA) в буфере PBS, и лучшие результаты получаются при увеличении времени инкубации с этим раствором. После каждого шага, включая блокировку, необходимо смывать оставшийся раствор.

Иммуноокрашивание или иммуноокрашивание

Процедура иммуноокрашивания или иммуноокрашивания будет зависеть главным образом от того, является ли это прямой или непрямой иммунофлуоресценцией (см. Ниже).

Если это первичная или прямая иммунофлуоресценция, образцы будут инкубированы с желаемыми антителами, которые должны быть связаны с флуоресцентными красителями. Процедура инкубации заключается в разведении антитела в растворе, который также будет содержать BSA, но в меньшем количестве.

В случае вторичной или непрямой иммунофлуоресценции следует провести две последовательные инкубации. Сначала с желаемыми антителами, а затем с антителами, которые способны обнаруживать константные области первичных иммуноглобулинов. Именно эти вторичные антитела ковалентно связаны с флуорофорами.

Этот метод очень универсален, позволяя одновременно маркировать более одного антигена на образец, если первичные антитела связаны с разными флуорофорами, в случае прямой иммунофлуоресценции.

Для одновременного мечения при непрямой иммунофлуоресценции необходимо убедиться, что каждое первичное антитело продуцируется у разных животных, а также что каждое вторичное антитело связано с другим флуорофором.

Как и блокирование, инкубация с антителами дает лучшие результаты, чем дольше это время. После каждого шага необходимо смывать лишние антитела, которые не связались с образцами, а при вторичной иммунофлуоресценции необходимо блокировать перед добавлением вторичных антител.

В некоторых методах используются другие окрашивания, не связанные с иммуноокрашиванием, такие как окрашивание ядерной ДНК флуорофором DAPI.

Сборка и наблюдение

Во время последней инкубации с флуорофорами необходимо, чтобы образцы оставались в темноте. Для наблюдения под микроскопом обычно используют некоторые вещества, чтобы сохранить флуоресценцию флуорофоров, связанных с антителами.

Типы

Графическое резюме прямой и непрямой иммунофлуоресценции (Источник: Westhayl618 через Wikimedia Commons)

Прямая или первичная иммунофлуоресценция

Это связано с обнаружением антигенов с помощью флуоресцентных антител. Основным преимуществом использования этого метода является его скорость, однако в процессе может происходить множество случаев неспецифического связывания, особенно при изучении сыворотки крови человека, поскольку она богата высокогетерогенными антителами.

Непрямая или вторичная иммунофлуоресценция

Он также известен как техника «сэндвича» и включает в себя разработку техники в два этапа. Первый связан с использованием нефлуоресцентного антитела и его связыванием с интересующим антигеном.

Против константной области этого первого антитела (которое теперь будет служить антигеном) используется второе антитело, способное его распознавать, которое связано с флуоресцентной молекулой.

Появление флуоресцентного сигнала будет результатом специфического распознавания между первым нефлуоресцентным антителом и представляющим интерес антигеном; Присутствие этого первого антитела обусловливает присутствие второго, которое помечено и благодаря которому можно определить присутствие или отсутствие антигена.

Несмотря на то, что это гораздо более трудоемкий метод, чем прямая иммунофлуоресценция (поскольку он включает в себя еще один этап инкубации), этот метод не включает создание флуоресцентных антител для каждого исследуемого антигена, что с экономической точки зрения приводит к следующему: более жизнеспособный.

Кроме того, это более чувствительный метод с точки зрения усиления сигнала, поскольку более одного вторичного антитела может связываться с константной областью первичного антитела, таким образом усиливая интенсивность флуоресцентного сигнала.

Приложения

Как, возможно, было отмечено ранее, иммунофлуоресценция - чрезвычайно универсальный метод, который использовался многими способами в научных и клинических областях. Его можно использовать для ответа на экологические, генетические и физиологические вопросы, касающиеся многих организмов.

Среди клинических применений он используется для прямой диагностики некоторых дерматологических заболеваний с использованием прямой или непрямой иммунофлуоресценции эпителиальной ткани исследуемых пациентов.

Методы иммунофлуоресценции доступны для одноклеточных организмов, таких как дрожжи, для визуализации внутриядерных и цитоплазматических микротрубочек, актина и связанных белков, 10-нм филаментов и других компонентов цитоплазмы, мембраны и клеточных стенок.

Ссылки

1. Abcam, протокол иммуноцитохимии и иммунофлуоресценции. Получено с abcam.com
2. Греф, К. (2012). Флуоресцентные красители. Получено с leica-microsystems.com
3. Миллер, Д.М., и Шакест, округ Колумбия (1995). Иммунофлуоресцентная микроскопия. В «Методах клеточной биологии» (том 48, стр. 365–394). Academic Press, Inc.
4. Оделл, И.Д., и Кук, Д. (2013). Методы иммунофлуоресценции. Журнал следственной дерматологии, 133, 1–4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, и Brian, K. (1991). Иммунофлуоресцентные методы дрожжей. В «Методах энзимологии» (том 194, стр. 565–602). Academic Press, Inc.
6. Шеффер М., Орси Э. В. и Уайдлок Д. (1964). Применение иммунофлуоресценции в вирусологии общественного здравоохранения. Bacteriological Reviews, 28 (4), 402–408.
7. Врилинг, Э. Г., и Андерсон, Д. М. (1996). Иммунофлуоресценция в исследованиях фитопланктона: приложения и возможности. J: Phycol. , 32, 1–16.