АГАР МЮЛЛЕРА-ХИНТОНА: ОСНОВА, ПОДГОТОВКА И ПРИМЕНЕНИЕ - БИОЛОГИЯ - 2024

Мюллер - Хинтон Агар не является селективной, твердая питательной среда состоит из мяса инфузии, пептон кислоты казеина, крахмала, агара и дистиллированной воду. Эта среда обеспечивает отличный микробный рост для большинства быстрорастущих бактерий.

Первоначально он был создан Джоном Ховардом Мюллером и Джейн Хинтон для выделения таких требовательных к питанию бактерий, как Neisseria gonorrhoeae и Neisseria meningitidis. Однако благодаря своим характеристикам он оказался идеальным для изучения чувствительности к антибиотикам, обеспечивая надежные и воспроизводимые результаты.

Антибиограммы (агар Мюллера-Хинтона). Источник: доктор Грэм Бердс, en.wikipedia

Таким образом, агар Мюллера-Хинтона является культуральной средой, принятой Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI) и Европейским комитетом по тестированию чувствительности к противомикробным препаратам для проведения теста на чувствительность к противомикробным препаратам методом дисковой диффузии Кирби и Bauer.

основа

Будучи неселективной питательной средой, она отлично подходит для роста большинства патогенных бактерий.

С другой стороны, его простой состав позволяет веществам легко диффундировать на нем, что является важной характеристикой для теста на чувствительность методом дисковой диффузии.

Другой его характеристикой является то, что он содержит небольшое количество ингибиторов, что позволяет эффективно оценивать сульфонамиды, триметоприм и тетрациклины.

Однако следует иметь в виду, что среда должна соответствовать определенным условиям для обеспечения ее надлежащего функционирования, в том числе:

Регулировка pH, глубины агара и соответствующей концентрации тимина, тимидина, Ca ⁺⁺ , Mg ⁺⁺ и Zn ⁺⁺ .

Вы также должны знать, что методология стандартизирована и поэтому должны быть соблюдены все параметры, такие как:

Концентрация посевного материала, концентрация и сохранение дисков с антибиотиками, размещение соответствующего количества дисков на агаре, расстояние между одним диском и другим, стратегическое размещение определенных антибиотиков, атмосфера, температура и время Инкубационный.

подготовка

Взвешивают 37 г обезвоженной среды Мюллера-Хинтона и растворяют в 1 литре дистиллированной воды. Нагрейте среду, помешивая, чтобы способствовать растворению. Варить 1 минуту.

Автоклав для стерилизации при 121 ° C в течение 15 минут. При извлечении из автоклава колбу следует поместить на водяную баню при 50 ° C для охлаждения. Разлить по 25–30 мл в стерильные чашки Петри диаметром 10 см.

Пластины должны быть средней толщины 4 мм (идеальная), допускается диапазон 3-5 мм.

Если необходимо приготовить кровяной агар с использованием агара Мюллера-Хинтона в качестве основы, перед подачей на чашки налейте 5% стерильную и дефибринированную кровь ягненка.

Конечный pH среды должен быть от 7,2 до 7,4.

Инвестируйте и храните в холодильнике до использования. Перед использованием дайте пластине нагреться до комнатной температуры.

Цвет подготовленной среды - светло-бежевый.

Приложения

Он используется для проведения антибиотикограммы или теста на чувствительность к антибиотикам для большинства быстрорастущих нетребовательных патогенов.

Если в агар добавляется кровь, он используется для проведения антибиотикограммы таких требовательных микроорганизмов, как Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis и других. Он также использовался для изоляции Legionella pneumophila.

Методика антибиограммы

Перед проведением антибиотикограммы необходимо приготовить бактериальный раствор, эквивалентный 1,5 x 10 ⁸ клеток.

Для этого отбирают от 3 до 4 колоний чистой культуры и суспендируют в бульоне с триптиказой сои или в бульоне Мюллера-Хинтона, инкубируют в течение 2-6 часов, и концентрацию корректируют стерильным физиологическим раствором, сравнивая ее со стандартом Mac Farland. 0,5%.

Если они нуждаются в микроорганизмах, колонии можно суспендировать непосредственно до концентрации 0,5% Mac Farland. Затем на чашку Müeller Hinton засевают тампон, пропитанный приготовленным бактериальным раствором.

Для этого тампон погружают в раствор, а затем удаляют лишнюю жидкость, нажимая на стенки пробирки. Сразу после этого тампон проводят по всей поверхности, не оставляя нетронутых мест, затем пластину слегка поворачивают и снова засевают. Операция повторяется еще 2 раза.

Дайте постоять 10 минут, а затем вставьте диски с антибиотиками стерильными щипцами, оставив между ними зазор 24 мм. Поместив каждый диск на агар, слегка надавите на каждый диск щипцами, чтобы убедиться, что они хорошо прилегают.

По завершении процесса планшет переворачивают и инкубируют при 35-37 ° C в условиях аэробиоза в течение 16-18 часов. Если это требовательный микроорганизм, он может иметь микроаэрофилию, и если антибиотикограмма содержит диски оксациллина, ее следует прочитать через 24 часа.

Для измерения диаметра каждого ореола используется линейка. Результаты следует записать в мм. Впоследствии полученные значения сопоставляются с таблицами точек отсечки, опубликованными в текущем руководстве CLSI.

Измерение ореола ингибирования. Источник: USCDCP, Pixnio.com

Укажите как чувствительный (S), промежуточный (I) или устойчивый (R), в зависимости от обстоятельств.

Антибиотики выбираются в зависимости от изолированного микроорганизма и типа инфекции, которую он вызывает.

Иногда необходимо помнить о стратегическом размещении антибиотиков, чтобы выявить фенотипические паттерны устойчивости.

Стратегическое размещение дисков на агаре Мюллер-Хинтон

Для энтеробактерий диск с клавулановой кислотой должен быть помещен против цефалоспоринов 3-го и 4-го поколения. Расширение в форме яйца указывает на то, что штамм является продуцентом бета-лактамаз расширенного спектра действия (БЛРС). Это означает, что пациента нельзя лечить цефалоспоринами.

Фенотипическая экспрессия продукции бета-лактамаз расширенного спектра (ESBL) в штамме Escherichia coli. Источник: Фотография автора MSc. Мариельса Гиль

При стафилококке важно поместить диск с эритромицином или азитромицином перед диском с клиндамицином (D-тест).

Устойчивый ореол в эритромицине и уплощение в ореоле клиндамицина указывает на то, что штамм обладает штаммом индуцируемой резистентностью к клиндамицину (ICR). Это означает, что лечение клиндамицином не будет эффективным.

Для поиска индуцибельных штаммов AMP C в Enterobacteriaceae и некоторых неферментирующих грамотрицательных палочках диски тазобактана, цефтазидима, цефокситина или пиперациллина обращены к диску имипенема на расстоянии 27 мм.

Уплощенный ореол на одном из дисков, обращенных к имипенему, указывает на присутствие индуцибельного AMP C.

Для поиска конститутивного AMP C диск клоксациллина 500 мкг обрабатывают цефтазидимом (30 мкг) и цефотаксимом (30 мкг) на расстоянии 25 мм. Расширенный ореол в любом из цефалоспоринов указывает на позитив.

Клоксациллиновый диск можно также заменить на 9-миллиметровый диск из фильтровальной бумаги Whatman № 6, пропитанный фенилборной кислотой (400 мкг), на расстоянии 18 мм. Он интерпретируется так же, как и предыдущий.

Наконец, чтобы исследовать продукцию металлобеталактамаз, особенно в Pseudomonas aeruginosa, используется диск, пропитанный 10 мкл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА 750 мкг) и тиогликолевой кислоты (SMA 300 мкг), который противостоит дискам имипенема и меропенема. на расстоянии 15 мм.

Тест является положительным, если наблюдается расширение ореолов имипенема или меропенема в направлении диска EDTA / SMA. Этот результат должен быть подтвержден модифицированным тестом Ходжа.

Этот метод заключается в инокуляции штамма Escherichia coli ATCC 25922 на чашку Müeller Hinton. Диск имипенема помещают в центр пластины, а затем от диска к периферии делают полосу с подозреваемым штаммом P. aeruginosa. На чашку можно проверить до 4 штаммов.

Тест будет положительным, если вокруг растяжки имеется зона искажения ореола имипенема.

Причины ошибочных результатов

- Плохо сохраненные диски с антибиотиками могут вызвать ложную резистентность. Например, оксациллиновый диск очень уязвим к перепадам температуры.

- pH среды ниже указанного (кислая) дает меньшие ореолы у аминогликозидов и макролидов (риск ложной резистентности) и большие ореолы у пенициллина, тетрациклина и новобиоцина (риск ложной чувствительности).

-Если pH выше указанного (щелочной), эффекты, описанные выше, меняются на противоположные.

-Средства с высокими концентрациями тимина и тимидина оказывают влияние, значительно уменьшая ореолы ингибирования сульфаниламидов и триметоприма.

-Высокие концентрации кальция и магния вызывают ложную резистентность аминогликозидов, полимиксина В и тетрациклинов к штаммам синегнойной палочки.

-Низкие концентрации кальция и магния вызывают ложную чувствительность к аминогликозидам, полимиксину B и тетрациклинам против штаммов Pseudomonas aeruginosa.

-Присутствие цинка влияет на результаты работы дисков карбапенема (имипенем, меропенем и эртапенем).

-Толщина среды ниже 3 мм приведет к ложным результатам чувствительности, а толщина более 5 приведет к ложному сопротивлению.

-Мобилизация дисков на антибиотикограмме даст деформированные ореолы, так как разряд антибиотиков происходит немедленно.

- Очень слабые посевные материалы влияют на результаты, поскольку в агаре не будет равномерного или сплошного роста, что является необходимым условием для измерения ореолов ингибирования, в дополнение к тому факту, что ореолы могут давать больше, чем обычно.

- Чрезмерно загруженный посевной материал может давать ореолы меньшего размера, чем обычно.

-Несоблюдение расстояния между дисками приводит к наложению одного ореола на другой, и они не могут быть правильно прочитаны.

-Инкубирование с CO ₂ увеличивает размер ореолов тетрациклиновых и метициллиновых дисков.

-Инкубирование при температуре ниже 35 ° C дает более крупные ореолы.

-Добавление крови уменьшает размер ореола сульфамида.

ограничение

Чувствительность антибиотика, продемонстрированная на антибиотикограмме, против микроорганизма (in vitro) не является гарантией того, что он будет работать in vivo.

контроль качества

Чтобы узнать, содержит ли среда достаточное количество тимина, необходимо посадить штамм Enterococcus faecalis ATCC 29212 и проверить чувствительность к триметоприм сульфаметоксазолу (SXT), чтобы он был удовлетворительным, он должен давать ореол, равный или> 20 мм.

Ссылки

1. «Агар Мюллера-Хинтона». Википедия, свободная энциклопедия. 16 ноя 2018, 12:23 UTC. 27 янв 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Микробиологический диагноз Бейли и Скотта. 12 изд. Редакция Panamericana SA Аргентина.
3. Cona E. Условия для хорошего исследования чувствительности методом диффузии в агаре. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Лаборатория Дифко Франсиско Сориа Мельгисо. Агар Мюллера-Хинтона с 5% овечьей крови. 2009 г. Доступно на: http://f-soria.es
5. Лаборатория агара BD Müeller Hinton II. 2017. Доступно на: .bd.com.
6. Britannia Laboratories. Агар Мюллера-Хинтона. 2015. Доступно на: britanialab.com.
7. Конеман Э, Аллен С., Джанда В., Шрекенбергер П., Винн В. (2004). Микробиологическая диагностика. 5-е изд. Редакция Panamericana SA Аргентина.
8. Мартинес-Рохас Д. Беталактамазы типа AmpC: Общие сведения и методы фенотипического обнаружения. Преподобный Soc. Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Доступно на: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Фенотипическое обнаружение металлобеталактамаз в клинических изолятах Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Доступно на: scielo.org.